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jinglz

铁虫 (初入文坛)

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[交流] 求助RT-PCR实验经验

求助!!
RT-RCR实验老是失败.
希望有心同仁能指点一二,不胜感激!!!
实验条件如下:
cDNA第一链合成
方法采用Promega公司的M-MLV反转录cDNA合成系统
反转录体系采用2ugＲＮＡ
根据上述定量结果，1号样品取2ul，2号样品取1ul加入消过毒的离心管中，每管中提加入2ulOligo(dt)15。70℃,加热5min。立即在冰上冷却试管，简单离心使管底溶液聚集。
再按顺序依次加入下列组分.
M-MLV 5X Reaction Buffer    5μl
dATP, 10mM                1.25μl
dCTP, 10mM                1.25μl
dGTP, 10mM                1.25μl
dTTP, 10mM                1.25μl
RNasin抑制剂                25 units
M-MLV RT                200 units
去离子水最终体积          25μl
轻弹管子混匀， 42℃孵育60min。
反应结束后，99℃加热5min,反转录酶失活。冷却。
(2) PCR扩增反应
为了确定最适的反应条件，选用了不同的反应体系（如下所示）
PCR条件： 95 ℃、90 s， 95 ℃、1 min，56 ℃、1 min 和72 ℃、2min，共25个循环次数，最终的延长是在 72 ℃ 、 7 min ，样品在4 ℃孵育直至分析。
PCR产物鉴定
取10ulPCR产物，用1%琼脂糖凝胶快速电泳，EB染色，紫外灯下观察条带。

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