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求助RT-PCR实验经验
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求助!! RT-RCR实验老是失败. 希望有心同仁能指点一二,不胜感激!!! 实验条件如下: cDNA第一链合成 方法采用Promega公司的M-MLV反转录cDNA合成系统 反转录体系采用2ugＲＮＡ 根据上述定量结果，1号样品取2ul，2号样品取1ul加入消过毒的离心管中，每管中提加入2ulOligo(dt)15。70℃,加热5min。立即在冰上冷却试管，简单离心使管底溶液聚集。 再按顺序依次加入下列组分. M-MLV 5X Reaction Buffer 5μl dATP, 10mM 1.25μl dCTP, 10mM 1.25μl dGTP, 10mM 1.25μl dTTP, 10mM 1.25μl RNasin抑制剂 25 units M-MLV RT 200 units 去离子水最终体积 25μl 轻弹管子混匀， 42℃孵育60min。 反应结束后，99℃加热5min,反转录酶失活。冷却。 (2) PCR扩增反应 为了确定最适的反应条件，选用了不同的反应体系（如下所示） PCR条件： 95 ℃、90 s， 95 ℃、1 min，56 ℃、1 min 和72 ℃、2min，共25个循环次数，最终的延长是在 72 ℃ 、 7 min ，样品在4 ℃孵育直至分析。 PCR产物鉴定 取10ulPCR产物，用1%琼脂糖凝胶快速电泳，EB染色，紫外灯下观察条带。 |
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zhyl1984
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