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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 综合其他 » 【求助/交流】菌种冷冻干燥保存的问题
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love_in_em

木虫 (著名写手)

[交流] 【求助/交流】菌种冷冻干燥保存的问题

1. 安瓿瓶哪里买？那种长颈小容量瓶样式的瓶子算安瓿瓶吗，哪里可以买？
2. 能否将菌液（加了脱脂牛奶）先冷冻，然后直接在真空干燥机里抽真空？
3. 冷冻干燥需要专用的设备吗？像2.那样抽成真空用脱脂棉塞住或用喷灯熔封是否可以？
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1楼 2011-02-15 21:17:15
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wt3532

木虫 (著名写手)
★ ★ ★
love_in_em(金币+1): 实用!摇瓶菌悬液与脱脂牛奶混合行不行？ 2011-02-18 19:32:35
lstt09nk(金币+3): 感谢交流 2011-02-18 20:23:27
菌苔和灭菌脱脂牛奶混合，放到冻干管中，塞上棉花，先预冻，再上真空冷冻干燥机，干燥完毕后用真空泵（水泵或油泵）抽冻干管，然后用酒精喷灯（一般酒精灯不行）烧管颈，烧熔。-20度保存，大功告成。
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6楼2011-02-18 16:40:04
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golen

新虫 (小有名气)
★ ★
最爱花诗雨(金币+2): 鼓励参与交流 2011-02-16 09:05:57
love_in_em(金币+1): 谢谢 2011-02-17 08:23:57
love_in_em(金币+1): 谢谢 2011-04-25 14:52:28
1、安培管是有专门的厂家定做的，或者是去玻璃仪器的公司，说明你的技术要求后，能定做的。
2、 真空冷冻的过程是慢冻，先预冷冻，然后用液氮冷冻，最后上真空冷冻干燥机上抽干，用煤气封口安培管。
3、有专门的真空冷冻干燥机。可以联系厂家购买。
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2楼2011-02-16 08:53:56
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wqj1988926

金虫 (正式写手)
★ ★ ★
dhd997(金币+3): 谢谢交流 2011-02-16 10:38:24
1.领试剂的地方应该可以领到的吧
2.我一般是加入15-20%的甘油（需提前高温灭菌）混合后预冻至-15度后再放入的
3其实在实验室保存个人觉得有专用的设备比较好，没有的话也是可以的
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3楼2011-02-16 08:56:21
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rural2084

木虫 (正式写手)
★ ★
翱宇(金币+2): 鼓励交流 2011-02-16 12:56:31
love_in_em(金币+1): 谢谢 2011-02-17 08:24:21
楼主可以参考下面的方法
真空冷冻干燥法

将微生物冷冻，在减压下利用升华作用除去水分，使细胞的生理活动趋于停止，从而长期维持存活状态。
操作步骤如下：
好氧菌冷冻干燥管的制备
1 安瓿管准备
安瓿管材料以中性玻璃为宜。清洗安瓿管时，先用2%盐酸浸泡过夜，自来水冲洗干净后，用蒸馏水浸泡至pH中性，干燥后、贴上标签，标上菌号及时间，加入脱脂棉塞后，121℃下高压灭菌15-20分钟，备用。
2 保护剂的选择和准备
保护剂种类要根据微生物类别选择。配制保护剂时，应注意其浓度及pH值，以及灭菌方法。如血清，可用过滤灭菌；牛奶要先脱脂，用离心方法去除上层油脂，一般在100℃间歇煮沸2-3次，每次10-30分钟，备用。
3 冻干样品的准备
在最适宜的培养条件下将细胞培养至静止期或成熟期，进行纯度检查后（参见科技部自然科技资源平台联合管理办公室文件《微生物菌种纯度检测技术规程》（试行）），与保护剂混合均匀，分装。微生物培养物浓度以细胞或孢子不少于108-1010个/ml为宜（以大肠杆菌为例，为了取得每毫升1010个活细胞菌液2毫升-2.5毫升，只需10毫升琼脂斜面两支）。采用较长的毛细滴管，直接滴入安瓿管底部，注意不要溅污上部管壁，每管分装量约0.1-0.2毫升，若是球形安瓿管，装量为半个球部。若是液体培养的微生物，应离心去除培养基，然后将培养物与保护剂混匀，再分装于安瓿管中。分装安瓿管时间尽量要短，最好在1-2小时内分装完毕并预冻。分装时应注意在无菌条件下操作。
4 预冻
一般预冻2小时以上，温度达到-20℃到-35℃左右。
5 冷冻干燥
采用冷冻干燥机进行冷冻干燥。
将冷冻后的样品安瓿管置于冷冻干燥机的干燥箱内，开始冷冻干燥，时间一般为8-20小时。
6 真空封口及真空检验
将安瓿管颈部用强火焰拉细，然后采用真空泵抽真空，在真空条件下将安瓿管颈部加热熔封。
熔封后的干燥管可采用高频电火花真空测定仪测定真空度。
7 保藏
安瓿管应低温避光保藏。
8 质量检查
冷冻干燥后抽取若干支安瓿管进行各项指标检查，如存活率、生产能力、形态变异、杂菌污染等。
厌氧菌冷冻干燥管的制备
主要程序与需氧菌操作相同，注意保护剂的选择和准备，保护剂使用前应在100℃的沸水中煮沸15分钟左右，脱气后放入冷水中急冷，除掉保护剂中的溶解氧。
复苏方法
—— 先用70%酒精棉花擦拭安瓿上部，
—— 将安瓿管顶部烧热，
—— 用无菌棉签沾冷水，在顶部擦一圈，顶部出现裂纹，用挫刀或镊子颈部轻叩一下，敲下已开裂的安瓿管的顶端，
—— 用无菌水或培养液溶解菌块，使用无菌吸管移入新鲜培养基上，进行适温培养。

参考
http://www.china-cicc.org/preserve/index.html
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4楼2011-02-16 12:38:39
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