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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】关于启动子区域克隆
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mmzhang

新虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】关于启动子区域克隆 已有10人参与

最近在构建GUS 载体，但是遇到了一个大问题：我已经通过多次的Tail-PCR得到了大约2000bp的启动子区域的序列（序列是根据几次的Tail-PCR测序结果拼接起来的），然后本人根据得到的序列设计了两对引物准备扩增得到片段并构建GUS载体，但是做了几次PCR后一个条带都没有，已经试了不同的PCR条件还是不行，我用的聚合酶是Takara的HS primerstar，现在不知道该怎么办了，请各位大侠能够提供一些意见和建议。
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1楼 2011-02-15 16:45:18
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daydayup2005

银虫 (小有名气)
怀疑是不是拼接的有问题导致引物设计出现问题?
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2楼2011-02-16 19:50:38
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mmzhang

新虫 (小有名气)
也考虑过这个问题，但是我重复了两次序列拼接，应该没有问题吧
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3楼2011-02-18 09:46:12
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夏尔list

金虫 (著名写手)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
dhd997(金币+2): 谢谢交流 2011-02-18 10:48:49
其实我是想问一下，启动子连GUS的话，必须是精确到ＡＴＧ前面么？多不行少也不行么？如果该基因前２０００bp包括了另外一个基因的部分区域呢，它也算是启动子区域么？
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4楼2011-02-18 09:50:19
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dhd997

荣誉版主 (文坛精英)

自由人，我型我秀！

优秀版主
引用回帖:
Originally posted by mmzhang at 2011-02-18 09:46:12:
也考虑过这个问题，但是我重复了两次序列拼接，应该没有问题吧

引用回复，方便交流
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人生不过几十年，成败荣辱都在天，是非恩怨莫在意，健康快乐最值钱，自古人间苦无边，看得高远境如仙，愿你不为凡事恼，轻松快乐每一天。
5楼2011-02-18 10:49:08
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wylee01

禁虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
本帖内容被屏蔽
6楼2011-02-18 11:23:06
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magy2006

木虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
tail-PCR的引物哪里可以检索到啊？我也想用一用……
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7楼2011-02-18 13:05:04
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rioarsenal

金虫 (正式写手)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
lstt09nk(金币+2): 感谢交流 2011-02-18 20:08:57
引用回帖:
Originally posted by mmzhang at 2011-02-15 16:45:18:
最近在构建GUS 载体，但是遇到了一个大问题：我已经通过多次的Tail-PCR得到了大约2000bp的启动子区域的序列（序列是根据几次的Tail-PCR测序结果拼接起来的），然后本人根据得到的序列设计了两对引物准备扩增得到片 ...

1、拼接错误

2、设计的引物PCR条件不对

3、可以考虑用巢式做一下，看是否能扩出来
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8楼2011-02-18 14:39:12
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mmzhang

新虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by rioarsenal at 2011-02-18 06:39:12:
1、拼接错误

2、设计的引物PCR条件不对

3、可以考虑用巢式做一下，看是否能扩出来

谢谢了，准备设计新的引物再做一次巢式，希望能成功！
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9楼2011-02-21 12:16:26
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奔跑的乌拉龟

铜虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
1021595楼: Originally posted by magy2006 at 2011-02-18 13:05:04
tail-PCR的引物哪里可以检索到啊？我也想用一用……

兼并引物么？兼并引物你如果要是做植物的话可以看看刘耀光的那篇文章
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脚踏实地
10楼2013-03-24 19:55:58
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