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cyz20050505木虫 (正式写手)
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[交流]
【求助/交流】问个有关荧光定量的棘手问题，来了好几个技术支持都找不出原因。
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1.仪器：ABI7300实时定量PCR系统 2.前提条件：仪器各种的验证程序，验证板反应均为正常。在其上做绝对定量反应均为正常 3.问题来了：我首先用用普通PCR和琼脂糖电泳验证了有扩增且条带非常单一，无引物二聚体，拖尾，拖带，等一些不和谐现象，于是我就上7300，程序与参数设置也是正确的，这是发现在有ROX参比荧光的条件下，扩增曲线在进入对数增长期就断了，去掉ROX，则是正常曲线，于是我单独分析ROX，发现在扩增进入对数增长期时，ROX的信号掉到了0以下，所以导致曲线中断，但是消除ROX后，孔间重复性非常差，显然误差是极大的。于是乎我又更换了TaKaRa，TIANGEN，ABI，BioRad的荧光试剂，结果都是如此，让我悲剧了很长很长很长的时间，在不的已的情况，我去其他地方换7500做，同样的样品和试剂，就一点问题没有，ROX的信号一直很稳定，扩增曲线非常漂亮，孔间误差极小。 4.所以我怀疑：检测ROX的部件有问题?软件算法有问题？还是机器其他地方有问题，没有检测到？对于上述问题，所谓的大工程师们给不了我一个明确有用的答复，只知道做标准板，标准板是加了Taqman探针的绝对定量，是没有问题，但我们只做SYBRGreen，就是死活不行。此时此刻，又勾起了我伤心的记忆，因为我马上又不的不背起一大堆东西去别的地方做实验。 5.请大家支招，谢谢！！下次我把图片传上来，大家分析分析。 |
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