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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 综合其他 » 【求助/交流】在TEM电镜之前 如何处理细菌样品
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wy0904

新虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】在TEM电镜之前 如何处理细菌样品已有1人参与

之前照的是 SEM，但是觉得TEM更清楚，所以希望诸位有经验的同学赐教~~是要用戊二醛吗？
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1楼2010-12-25 22:17:01
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85738816

木虫 (正式写手)
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由于电镜电子束穿透能力的限制，必须把标本切成厚度小于0.1um以下的薄片才适用，这种薄片称为超薄切片。常用的超薄切片厚度是50-70nm。
   在透射电镜的样品制备方法中，超薄切片技术是最基本、最常用的制备技术。超薄切片的制作过程基本上和石蜡切片相似，需要经过取材、固定、脱水、浸透、包埋聚合、切片及染色等步骤。
   一 取材的基本要求
   组织从生物活体取下以后，如果不立即进行适当处理，会由于细胞内部各种酶的作用，出现细胞自溶现象。此外，还可能由于污染，微生物在组织内繁殖使细胞的微细结构遭受破坏。因此，为了使细胞结构尽可能保持生前状态，必须做到快、小、准、冷：
(1)．动作迅速，组织从活体取下后应在最短时间内 (争取在1分钟内) 投入2.5%戊二醛固定液。
(2)．所取组织的体积要小，一般不超过1mm×1mm×1mm。也可将组织修成1mm×1mm×2mm大小长条形。因为固定剂的渗透能力较弱，组织块如果太大，块的内部将不能得到良好的固定。
(3)．机械损伤要小，解剖器械应锋利，操作宜轻，避免牵拉、挫伤与挤压。
(4)．操作最好在低温(0℃～4℃)下进行，以降低酶的活性，防止细胞自溶。
(5)．取材部位要准确。
  取材方法：将取出的组织放在洁净的蜡版上，滴一滴预冷的固定液，用两片新的、锋利的刀片成“拉锯式”将组织切下并修小，然后用牙签或镊子将组织块移至盛有冷的固定液的小瓶中。如果组织带有较多的血液和组织液，应先用固定液洗几遍，然后再切成小块固定。
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合作共赢共同发展
4楼2011-01-10 20:19:47
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85738816

木虫 (正式写手)
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dhd997(金币+1):谢谢交流 2011-01-09 13:55:50
silicare(金币-10):AD 2011-01-10 12:37:59
silicare:编辑内容 2011-01-10 12:38
戊二醛固定后，还要漂洗，包埋，切边等步骤。北京*****做生物制样

[ Last edited by silicare on 2011-1-10 at 12:38 ]
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合作共赢共同发展
2楼2011-01-09 13:14:48
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85738816

木虫 (正式写手)
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透射电镜生物样品制备步骤

一．取材：
组织块小于1立方毫米
二．固定：        
2.5%戊二醛，磷酸缓冲液配制固定2小时或更长时间。
用0.1M磷酸漂洗液漂洗         15分 三次
1%锇酸固定液固定                2-3小时
用0.1M磷酸漂洗液漂洗         15分 三次
三．脱水：        
50%乙醇                        15-20分
70%乙醇                        15-20分
90%乙醇                        15-20分
90%乙醇 90%丙酮（1：1）        15-20分
90%丙酮                        15-20分
以上在4度冰箱内进行
100%丙酮           室温                 15-20分三次
四．包埋：        
纯丙酮+包埋液（2：1）室温 3-4小时
纯丙酮+包埋液（1：2）室温 过夜
纯包埋液                   37度 2-3小时
五．固化：        
37度烘箱内                 过夜
45度烘箱内                 12小时
60度烘箱内                 24小时
六．超薄切片机切片 50-60 nm
七．3%醋酸铀-枸橼酸铅双染色
八．透射电镜观察。拍片
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合作共赢共同发展
3楼2011-01-10 20:14:18
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