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落雪含香金虫 (正式写手)
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[交流]
【求助】酶标仪测的吸光度如何反应存活细胞数目 已有6人参与
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体外药物对细胞毒性试验中，看文献中经常会用到MTT法，并用酶标仪来测吸光度，吸光值可以间接反应活细胞数目，请问大家： 首先，为什么要用酶标仪而不用紫外分光光度计？ 其次，用酶标仪测出的吸光值如何反应活细胞数目呢？ 在线等答案，谢谢各位了 |
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先介绍两个概念 1.MTT测细胞活力的原理。MTT全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide，是一种黄颜色的染料。活细胞线粒体中琥珀酸脱氢酶能够代谢还原MTT，同时在细胞色素C的作用下，生成蓝色（或蓝紫色）不溶于水的甲臜（Formazan），甲臜的多少可以用酶标仪在570nm 处进行测定。在通常情况下，甲臜生成量与活细胞数成正比，因此可根据光密度OD值推测出活细胞的数目。由于死细胞中不含琥珀酸脱氢酶，因此加入MTT 不会有反应。 2.什么是吸光值？假如仪器给出一个光强为A的特定波长的光，透过检测液体后，侦测到的该特定波长的光的强度为B，吸光值OD=log(A/B),吸光值为0，A=B代表检测液体无吸收；吸光值为1，代表A/B=10,仪器给出的光有90%被检测液吸收。读OD的实验的灵敏度一般都不太好，OD值最大也就3，也就是10的3次方的灵敏度，不如 fluorescence（10七次方）灵敏。 也就是说，活细胞数目越多，MTT的转换产物甲臜生成的越多，仪器发出的570nm的波长光被溶液吸收的越多，即OD=log(A/B),光透过溶液后侦测到光强越小，B值越小，OD值越大。酶标仪检测时好像还需要读490nm的波长以消除背景值OD=OD570-OD490。这个方法的灵敏度不够，只能相对，定性的测细胞的多或者少，无法定量计算细胞个数。 无论是分光光度计还是酶标仪，工作原理都是一样的，都可以进行检测的，但是酶标仪更加方便和快捷，适用于96孔板等微孔板的快速读数 |
6楼2013-06-02 17:55:08
谢谢 解决了我的燃眉之急 哈哈哈 7楼2015-04-17 14:00:34
