应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】PCR产物A加尾
52/1返回列表
查看: 3799  |  回复: 15
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

gdongli8325

铁杆木虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】PCR产物A加尾

我是用Phusion 高保真酶做的PCR，但所用的载体是TA载体，所以需要A加尾。第一次我是这样做的：先用试剂盒将PCR产物纯化，然后加buffer, Taq, dATP，但是没有加上。后来分析可能是保真酶的内切酶活性还存在，于是就用酚、氯仿 将PCR 纯化，然后进行A加尾，但还是失败了。本来以为这是很简单的事情，但折腾了很久了。所以在此请教大家：究竟怎么样才能加上A尾巴？是否有既可以加上A又具有保真性的酶呢？因为要构建超表达载体，所以必须是保真的。
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
1楼 2010-11-03 05:56:01
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

amilie030312

金虫 (正式写手)
gdongli8325(金币+1): 2010-11-15 16:36:19
只有有校正能力的酶才叫高保真酶，有校正能力的酶都是3‘平末端的，如果要连到T载体里面一定要加A。只要像2楼说的那样加肯定没问题，只要Taq酶没问题切ATP/NTP酶问题就行，ATP看看是不是放太久了，半年以内吧，超过了都不太好。片段如果太长的话加起来有些困难，但也能加上
赞一下 回复此楼
12楼2010-11-15 10:27:39
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 16 个回答

anlewo7777

木虫 (正式写手)
gdongli8325(金币+1): 2010-11-14 20:39:06
直接用Taq的体系，用dNTP，保温72度30分钟就行了
赞一下 回复此楼
2楼2010-11-03 07:27:00
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zzq770204

至尊木虫 (著名写手)
★
dhd997(金币+1):谢谢交流。 2010-11-03 08:44:13
gdongli8325(金币+1): 2010-11-14 20:39:12
gdongli8325(金币+3): 2011-04-26 00:34:32
所有循环结束后，暂停反应，在反应体系中加少量taq酶，72℃40min即可。

用高保真酶正常PCR结束之后，加入taq酶及其相应buffer，72℃半小时即可！
赞一下(1人) 回复此楼
3楼2010-11-03 07:51:17
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lixg

铁杆木虫 (正式写手)
★
dhd997(金币+1):鼓励交流。 2010-11-03 08:44:21
gdongli8325(金币+1): 2010-11-14 20:39:16
推荐步骤：1. PCR产物回收。 2. 常规的加A步骤。
赞一下(1人) 回复此楼
4楼2010-11-03 08:42:35
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 16 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭