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virus501

新虫 (初入文坛)

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虫号: 1108292
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专业: 分子生物学

[交流] 【求助/交流】实验啊，老做不出来(HEV（正链RNA病毒）的全基因组克隆) 已有2人参与

小弟一直在做HEV（正链RNA病毒，粪口传播）的全基因组克隆。可是一直没结果。现在把我的条件拿出来，请各位高手帮我分析一下原因吧，郁闷死了！
一：RNA的提取
用OMEGA试剂盒提取猪粪中的RNA。（猪粪用PBS溶解）。
二：RT
反转录用的是MBI试剂盒。RNA定量为1ug。反转录引物用过特异性引物和oligo（dT）。或者两者混合。
三：PCR
PCR所用引物特异性很好（软件比对结果显示），cDNA加2ul。
四：目的片段
一个长1.2k。一个约6.35k。1.2k的用的是TAKARA的普通Taq酶。6.35k的用的是TAKARA的LA Taq酶。
结果：
可以说一直没有结果。1.2kP出的条带都小于500bp，要不就什么都没有。6.35k的结果也一样，要不什么都没有，要不在9.6k处有一条不清晰的带（不可能，因为HEV基因组全长才7.2k）。

说明：RNA肯定是提出来了，因为做阳性筛选的时候扩增的436bp的条带每次重复都会出现，即阳性对照没问题（扩增片段靠近基因组3’端）；RT应该没问题，因为试剂盒中的阳性对照扩增也没问题。

小弟真的很郁闷，一个简单的RT-PCR都做不好，也难怪2个老板都十分恼怒。请各位高手帮我分析分析原因吧，谢谢了！

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