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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】PCR求助
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zhtongshi

铜虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】PCR求助

pcr实验
    做总DNA的PCR时，第一次能成功的做出来，而且做得非常好，但接下来再怎么做都失败。非常着急，请高人指点！
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1楼 2010-09-23 10:07:00
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时来运转1

铁虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
你好,我现在也遇到同样的问题了,引物重新合成一份了,PCR试剂用的是MIX,也是新买了一份,DNA是提取完立刻跑PCR的,但还是阴性,电泳什么东西都没有,只有MARKER跑出来了.后面我做了个内参PCR,全是全阳性.请问你后面是怎么解决的?(我是直接测序的,前面都成功测了三百多个了,后面就一直失败)谢谢!
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13楼2015-06-23 14:51:54
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qiangfeng

金虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★ ★
amisking(金币+5):欢迎分享经验！ 2010-09-23 19:02:22
zhtongshi(金币+1): 2010-09-28 09:26:24
我认为原因主要有两个：
1. 你第一次成功可能是总DNA提取后就立即做PCR，这时总DNA是完整的，
总DNA放一段时间后，总DNA已降解或受到损伤，使目的基因无法获得
2. 可能是你做PCR时用到的试剂出问题了，可以换用新试剂试试
另外，再问一下，你是用什么试剂提取的总DNA？
PCR时，都用的哪些公司的试剂？
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顺势而行，问心无愧！
2楼2010-09-23 10:31:09
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lixg

铁杆木虫 (正式写手)
提取DNA后最好在4度放置，以避免反复冻融引起DNA降解。
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3楼2010-09-23 13:44:11
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cxb-abc

银虫 (小有名气)
zhtongshi(金币+1): 2010-09-28 09:26:34
所双蒸水，枪头，灭菌再用，可能你的加样有问题吧！ DNA没问题，下游试验就考虑引物，酶，dNTPS等
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4楼2010-09-23 16:49:40
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