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bluewondeer银虫 (小有名气)
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一、植物组织蛋白质提取方法 1、根据样品重量（1g样品加入3.5ml提取液，可根据材料不同适当加入），准备提取液放在冰上。 2、把样品放在研钵中用液氮研磨，研磨后加入提取液中在冰上静置（3-4小时）。 3、用离心机离心8000rpm40min4℃或11100rpm20min4℃ 4、提取上清液，样品制备完成。 蛋白质提取液：300ml 1、1Mtris-HCl（PH8） 45ml 2、甘油（Glycerol）75ml 3、聚乙烯吡咯烷酮（Polyvinylpolypyrrordone）6g 这种方法针对SDS-PAGE，垂直板电泳！ 二、植物组织蛋白质提取方法 氯醋酸—丙酮沉淀法 1、在液氮中研磨叶片 2、加入样品体积3倍的提取液在-20℃的条件下过夜，然后离心（4℃8000rpm以上1小时）弃上清。 3、加入等体积的冰浴丙酮（含0.07%的β-巯基乙醇），摇匀后离心（4℃8000rpm以上1小时），然后真空干燥沉淀，备用。 4、上样前加入裂解液，室温放置30分钟，使蛋白充分溶于裂解液中，然后离心（15℃8000rpm以上1小时或更长时间以没有沉淀为标准），可临时保存在4℃待用。 5、用Brandford法定量蛋白，然后可分装放入-80℃备用。 药品：提取液：含10%TCA和0.07%的β-巯基乙醇的丙酮。裂解液：2.7g尿素0.2gCHAPS溶于3ml灭菌的去离子水中（终体积为5ml），使用前再加入1M的DTT65ul/ml。 这种方法针对双向电泳，杂质少，离子浓度小的特点！当然单向电泳也同样适用，只是电泳的条带会减少！ 三、组织：肠黏膜 目的：WESTERN BLOT检测凋亡相关蛋白的表达 应用TRIPURE提取蛋白质步骤： 含蛋白质上清液中加入异丙醇：（1.5ml每1mlTRIPURE用量） 倒转混匀，置室温10min 离心：12000 g，10min，4度，弃上清 加入0.3M盐酸胍/95％乙醇：（2ml每1mlTRIPURE用量） 振荡，置室温20min 离心： 7500g，5 min，4度，弃上清 重复0.3M盐酸胍/95％乙醇步2次 沉淀中加入100％乙醇 2ml 充分振荡混匀，置室温20 min 离心： 7500g，5min，4度，弃上清吹干沉淀 1％SDS溶解沉淀 离心：10000g，10min，4度 取上清-20度保存（或可直接用于WESTERN BLOT） 存在的问题：加入1％SDS后沉淀不溶解，还是很大的一块，4度离心后又多了白色沉定，SDS结晶？测浓度，含量才1mg/ml左右。 解决：提蛋白试剂盒，另外组织大小适中，要碎，立即加2X BUFFER，然后煮5－10分钟，效果很好的。 四、植物材料：水稻苗，叶鞘，根 1、200毫克样品置于冰上磨碎 2、加lysis buffer，离心，10000rpm，4度，5min取上清 3、重复离心5min lysis buffer：urea np-40 ampholine 2-me pvp-40 五、蛋白质样品制备 秧苗蛋白质样品的提取按Davermal等（1986）的方法进行。 100mg材料剪碎后加入10mgPVP-40(聚乙烯吡咯烷酮)及少量石英砂，用液氮研磨成粉，加入1.5 ml 10% 三氯乙酸（丙酮配制，含10mM即0.07%β-巯基乙醇），混匀，-20℃沉淀1小时，4℃，15000 r/min离心15 min，弃上清，沉淀复溶于1.5ml冷丙酮(含10 mMβ-巯基乙醇)，再于-20℃沉淀1小时，同上离心弃上清，（有必要再用80％丙酮(含10 mMβ-巯基乙醇所得沉淀低温冷冻真空抽干。 按每mg干粉加入20μl（可调） UKS液[9.5 M尿素，5mM碳酸钾，1.25%SDS，0.5%DTT(二硫苏糖醇)，2% Ampholine (Amersham Pharmacia Biotech Inc，pH3.5-10)，6% Triton X-100]，37℃温育30min，期间搅动几次，28度 （温度低，高浓度的尿素会让溶液结冰）16000 r/min离心15 min，离心力越大时间长一点越好！上清即可上样电泳。或者-70度保存 六、植物根中蛋白质的抽取 (1) sample, 液氮研磨 (2) 装1.5 ml centrifuge 用tube (3) 加 1M KH2PO4 K2HPO4 700 ul (4) 12000 rpm, 4度, 10-15minite (5) 取上层液，蛋白质就在里面 |
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2楼2011-08-14 15:53:48
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