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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】基因组PCR老P不出目的带
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398933174

★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
你的体系说下
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21楼2010-09-07 20:52:59
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whoisthis

铁虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
建议重新设计引物

设置阳性对照帮你更快找出原因：设计扩增同一目的基因其他位置或短一点的片段的引物
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22楼2010-09-08 04:28:56
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张晓梅ZXM

金虫 (正式写手)

meimeizhang
引用回帖:
Originally posted by kangkang997 at 2010-09-06 15:34:45:
延长时间是多少啊？

40s  45s  50s  90s  120s  都试过
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每天进步一点点，持之以恒！
23楼2010-09-08 08:25:16
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steven689

木虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
现在有PCR预混液，可以购买，只要你加的模板引物没有问题，其他的都是现成的
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24楼2010-09-08 08:58:59
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墨香若水

木虫 (著名写手)

小小囧虫
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
设计的引物可能有问题。 楼主最后溶解基因组是否用的是TE，也可能有影响。
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仕不可不弘毅，任重而道远
25楼2010-09-08 09:18:02
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yuanfeng

金虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
是不是模板加的太多了，稀释下试下吧。我们以前也遇到过这种情况，怎么做都pcr不出来，后来稀释了下模板就很快做出来了。
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26楼2010-09-08 11:36:39
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snzydong

铁杆木虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
建议1：是不是考虑重新设计引物PCR一下
      2：模板是不是没有问题，可以批一个其他的基因，小一点的试一试
      3：用的酶的扩增能力怎么样，我建议用La-Taq酶（TaKAra），即保真扩增能力 也强
       4：降低退火温度，DNTP含量增加，调整镁离子浓度
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27楼2010-09-08 20:05:42
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michaelwuqingyu

金虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
基因组的PCR有时候确实有点难，选个好的Taq很重要，我们以前用promega的P植物基因组重复性很差，经常扩不出来，换了ROCHE之后就相当稳定。不过ROCHE的tgo 高保真P cDNA 不好用。
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28楼2010-09-09 09:43:29
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diaoyuhua

金虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
应该是引物的问题，试下Touchdown
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29楼2010-09-09 11:13:34
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冬虫夏草1

金虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by lfkey at 2010-08-27 16:32:23:
温度太低特异性会减弱，我觉得不能低于60度，引物可以少加点，另外摸索退火温度时间隔可以再小点；重新设计引物到可以考虑一下。检测能否扩增出条带的话，我觉得应该没有酶或者buffer的事。

buffer也很重要，提供良好的环境必不可少
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倚楼听风雨，淡看江湖路！
30楼2010-09-09 13:44:10
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