【求助/交流】基因组PCR老P不出目的带 - 分子生物 - 综合其他

21楼2010-09-07 20:52:59

whoisthis

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建议重新设计引物

设置阳性对照帮你更快找出原因：设计扩增同一目的基因其他位置或短一点的片段的引物

22楼2010-09-08 04:28:56

张晓梅ZXM

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meimeizhang

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引用回帖:

Originally posted by kangkang997 at 2010-09-06 15:34:45:
延长时间是多少啊？

40s 45s 50s 90s 120s 都试过

赞一下

每天进步一点点，持之以恒！

23楼2010-09-08 08:25:16

steven689

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现在有PCR预混液，可以购买，只要你加的模板引物没有问题，其他的都是现成的

24楼2010-09-08 08:58:59

墨香若水

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设计的引物可能有问题。楼主最后溶解基因组是否用的是TE，也可能有影响。

仕不可不弘毅，任重而道远

25楼2010-09-08 09:18:02

yuanfeng

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是不是模板加的太多了，稀释下试下吧。我们以前也遇到过这种情况，怎么做都pcr不出来，后来稀释了下模板就很快做出来了。

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26楼2010-09-08 11:36:39

snzydong

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建议1：是不是考虑重新设计引物PCR一下
   2：模板是不是没有问题，可以批一个其他的基因，小一点的试一试
   3：用的酶的扩增能力怎么样，我建议用La-Taq酶（TaKAra），即保真扩增能力也强
   4：降低退火温度，DNTP含量增加，调整镁离子浓度

27楼2010-09-08 20:05:42

michaelwuqingyu

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基因组的PCR有时候确实有点难，选个好的Taq很重要，我们以前用promega的P植物基因组重复性很差，经常扩不出来，换了ROCHE之后就相当稳定。不过ROCHE的tgo 高保真P cDNA 不好用。

28楼2010-09-09 09:43:29

diaoyuhua

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应该是引物的问题，试下Touchdown

29楼2010-09-09 11:13:34

冬虫夏草1

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引用回帖:

Originally posted by lfkey at 2010-08-27 16:32:23:
温度太低特异性会减弱，我觉得不能低于60度，引物可以少加点，另外摸索退火温度时间隔可以再小点；重新设计引物到可以考虑一下。检测能否扩增出条带的话，我觉得应该没有酶或者buffer的事。

buffer也很重要，提供良好的环境必不可少

倚楼听风雨，淡看江湖路！

30楼2010-09-09 13:44:10