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whynotbest

至尊木虫 (职业作家)

淫虫

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[交流] 【求助】100金币求助各位一个HPLC的具体问题。

情况是这样的：小弟在用HPLC研究一个反应的方法学，看看各种不同的条件下哪个产率高。所以对不同反应条件下的反应液进行了HPLC检测。之前，先对标准品进行了条件摸索，最后用甲醇：水=65:35，峰形还可以。
但是在对不同的反应液进行检测时出现一点问题。在其中几种反应条件下，发现反应液的目标峰形竟然呈现双峰，如下图：

最高的那个峰是目标峰。在用标准品进样时，可以确定是一个单峰。而且在其他某些反应条件下，反应液也是一个单峰。如下图：

大家可以看到，对于某几组反应液，是很好的一个单峰。但是在某几组反应液进样时，就变成上述的双峰。

我的几个疑惑是：
1. 紫外吸收值很小，进样量也就30μL，应该不是超载吧。并且标准品都是单峰，吸收值比这个高得多，反应液没理由超载的。
2. 也不大可能是生成了其他与目标产物挨得很近的峰，因为我摸方法学的这个条件，只涉及到产率高低，不会因为条件不同生成其他东西的。

所以想问一下各位虫友，这样的情况怎么解释和处理呢？

[ Last edited by whynotbest on 2010-8-27 at 00:46 ]

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1楼 2010-08-27 00:43:17

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883475

银虫 (小有名气)

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whynotbest(金币+1): 2010-08-27 16:03:41
whynotbest(金币+4): 2010-08-27 16:07:00

楼主不是专业做研发分析的吧
首先，你的方法就是不成熟的，看你的流动相甲醇：水=65：35，进标品时主峰出峰时间7.8分钟，保留时间还是比较短的。
你可以走梯度：甲醇：水=15：85 0-5min
80：20 20-35min
流速1.0ml/min
水相的pH可以调节一下，看你样品的性质，如果有酚羟基、羧基等酸性基团，可以用磷酸盐调节成pH3左右的buffer，如有碱性基团反之；

如果梯度洗脱后，图一中的两个峰荏苒没有明显的分离，那就真的要考虑是不是异构体之类的了，看你的产物结构中是否有烯的结构？是否有手性中心？
如果是烯的顺反异构的话，建议你换正相，用硅胶柱试试，当然，如果有手性柱的话，可以直接用手性柱来分离试试