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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】5'Race反复做不出来，该怎么办
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阳光金鱼唐

金虫 (著名写手)

[交流] 【求助/交流】5'Race反复做不出来，该怎么办已有20人参与

用TaKaRa的5'Full Race试剂盒扩5’端，目的片段1000bp左右，每次都是内外引物都扩不出任何条带（除了引物二聚体外）。我是严格按照说明书操作的，感觉步骤太长，颠来倒去的到最后什么都没有了，我该怎么办？


谢谢大家了，这是很久以前的帖子了，我早就做出来了，用的TaKaRa的盒子，用的TaKaRa的盒子

[ Last edited by 阳光金鱼唐 on 2011-7-5 at 11:25 ]
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不知道什么是生活了，也不知道生活是什么了
1楼2010-08-16 10:33:02
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阳光金鱼唐

金虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by blackrose8089 at 2010-08-21 16:23:24:
楼主做的生物知道基因组序列吗？如果知道的话，可以根据预测的开放读码框设计引物看能否扩增出部分序列来，5'RACE 我用的传统的Tdt加尾法，关键是RNA的质量，invitrogen的SII好用些，再用相关的GSP和UP来扩增，找 ...

不是基因组序列，不知道开放阅读框
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不知道什么是生活了，也不知道生活是什么了
37楼2010-08-22 12:36:53
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阳光金鱼唐

金虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by siyuan4671 at 2010-08-21 20:35:25:
鉴于你的结果，我 认为原因可能在于两方面：一是反转效率和得率，如果要是你的基因在你提RNA组织里本来表达量极低，也会影响的，建议先做表达分析，看哪个组织表达量高，用哪个组织作模板；二可能是引物的问题，引 ...

可能是表达量低吧，我用同样的模板扩核心片段就扩不太亮，怎么调整都扩不亮。。。。这个基因有时候扩的出来有时候扩不出来，模板相当难搞定，难办啊！
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不知道什么是生活了，也不知道生活是什么了
38楼2010-08-22 12:41:36
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阳光金鱼唐

金虫 (著名写手)
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Originally posted by linxi8579 at 2010-08-21 21:55:13:

你说的比值不是越高越好啊，1.9的个人感觉比2.1的还好呢。另外只看比值不行，你要跑胶看一下RNA的完整性，有条件的话用Agilent2100生物分析仪检测就更好了。浓度估计也要很大的。总之用cDNA做模板扩长片段还是麻 ...

跑胶了的，图片效果还好啊
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不知道什么是生活了，也不知道生活是什么了
39楼2010-08-22 12:43:48
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阳光金鱼唐

金虫 (著名写手)
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Originally posted by linxi8579 at 2010-08-24 11:12:36:

不知道你问题解决了没有啊，我想除了重新提RNA等一些步骤。你已知的序列是多长，是怎么知道的啊，可以先用自己的已知的尽量长的扩扩，相当于做个阳性对照了。还有反转的试剂盒是什么，如果反的比较长用随机引物 ...

我已经扩出了核心片段和3‘端啊，下一步打算用环化法扩5‘端，自己设计个接头5’端磷酸化，再设计2对引物。先试试，不行再换方法。反转录不用试剂盒，买散装的试剂，加自己设计的特异性接头
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不知道什么是生活了，也不知道生活是什么了
41楼2010-08-24 12:02:55
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阳光金鱼唐

金虫 (著名写手)
我已经做出来了
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47楼2011-06-30 18:30:22
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阳光金鱼唐

金虫 (著名写手)
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2456558楼: Originally posted by dongfang12 at 2012-05-22 12:46:21:
请教，你怎么克的5‘RACE 的，我做了好久都不能拿到全长啊，真是郁闷惨了

操作要规范，一定要无菌操作，无RNA酶，退火温度用这个软件计算，在这个基础上减去5度，不放心就试试这个附近的温度http://sky.scnu.edu.cn/life/teac ... que/pcr_counter.htm
用平时的经验算退火温度做不出来的。
还有，PCR用的是高保真酶，我用的是TAKARA的盒子，配套的酶做不出来，换了高保真的酶就做出来了
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不知道什么是生活了，也不知道生活是什么了
55楼2012-05-22 15:11:25
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阳光金鱼唐

金虫 (著名写手)
引用回帖:
2456667楼: Originally posted by dongfang12 at 2012-05-23 14:00:03:
那这样的话，退货温度岂不是很低？达不到65度以上？这样也没有关系吗

为什么非要达到65度以上，你用的clonteck的盒子吗，降落PCR？
用TAKARA的话就用这个计算退火温度，的确比平时低一点，但做的出来
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不知道什么是生活了，也不知道生活是什么了
57楼2012-05-24 10:10:21
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阳光金鱼唐

金虫 (著名写手)
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2463744楼: Originally posted by oceanpig at 2012-08-21 08:56:51
楼主分享一下成功的具体步骤啊，小弟现在正做这方面实验呢，谢谢！还有就是TAKARA试剂盒大约要多少钱啊？

5000多。步骤参照说明书
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不知道什么是生活了，也不知道生活是什么了
67楼2012-08-21 09:24:04
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