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purpleboy623木虫 (正式写手)
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【推荐】973 重要生命活动中关键膜蛋白及蛋白质复合物的结构与功能研究已有7人参与
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项目名称： 重要生命活动中关键膜蛋白及蛋白质复合物的结构与功能研究 首席科学家： 张凯 中国科学院生物物理研究所 起止年限： 2011.1至2015.8 依托部门： 中国科学院 一、研究内容 围绕项目涉及的关键科学问题，我们要开展以下研究： 1. 细胞信号传导和能量代谢相关膜蛋白结构及调控机制的研究 GPCR是细胞外信号经过细胞膜传递给细胞内G蛋白而引起胞内一系列响应的关键性膜蛋白，人类有近1000个GPCR蛋白，具有相同的结构特点即主要由7次跨膜螺旋构成，其对外部分子的选择性来自其N端和胞外loop区的多样性，其信号跨膜传导具有一定的共性。本项目将在现有工作基础上选择人源蛋白酶受体1（PAR1）、神经抑制性受体GABA-B1和GABA-B2等GPCR蛋白作为研究对象，通过解析其三维结构研究其在循环系统和神经系统中的相关调控机制，并在此基础上探讨GPCR介导信号传导的一般规律。线粒体是细胞能量代谢发生的重要场所，氧化磷酸化是线粒体能量代谢的重要组成部分，主要由线粒体呼吸链复合物I、II、III、IV和ATP合成酶构成，其中复合物I的功能异常与众多神经退行性疾病和肿瘤有非常紧密的联系，作为包含46个亚基的巨大而复杂的膜蛋白复合体，其高分辨率结构至今未获解析。此外,线粒体的形态维持和变化与细胞凋亡、能量代谢、信号转导等细胞生物学过程密切相关。本项目将重点研究线粒体呼吸链复合物I的三维精细结构，揭示其电子传递和质子泵的机理，研究与线粒体分裂融合相关、线粒体－细胞骨架相互作用相关的膜蛋白复合体的三维结构和功能，探讨这些复合体在线粒体能量代谢调节中的作用。 2. 基因损伤修复相关蛋白质复合物的结构与机理研究 基因组的稳定性是各种生命活动的前提条件。基因组的稳定性通过DNA的准确复制、细胞周期调控和DNA修复等过程来实现。上述每一种过程中均存在多种具有重要功能的蛋白复合物，这些蛋白三维结构的解析对于了解基因损伤修复机理具有重要的意义。因此针对众多的细胞周期调控复合体以及不同形式DNA损伤的多种修复复合体的结构功能研究是当前生物医学中的热点领域。 本课题拟重点围绕基因损伤修复过程中蛋白质复合物的结构与功能开展系统研究，解析若干具有代表性和挑战性的维护基因组稳定性的蛋白质及其复合物的三维结构，结合生物化学与细胞生物学研究，阐明其结构与功能关系。 具体研究对象包括：DNA损伤修复中的磷酸化调控蛋白ATM的重要结构域与其相互作用蛋白的复合物,真核生物参与DNA跨损伤合成（translesion synthesis, TLS）的聚合酶以及相互作用蛋白复合物，原核生物DNA同源重组修复系统中重要蛋白及其复合物。此外，我们还将开展与DNA损伤修复相关的非编码RNA-蛋白质复合物的结构与功能研究,包括结核分支杆菌的DNA修复相关非编码RNA-蛋白质复合物结构与功能以及调控线虫典型DNA修复途径的非编码RNA-蛋白质的结构与功能研究。这些工作的完成，将极大地加深我们对于DNA 损伤修复机制的认识，从而为药物研发提供新的依据。 3. 蛋白质折叠中折叠酶和分子伴侣的结构与功能研究 重点围绕蛋白质折叠过程中分子伴侣与折叠酶的结构与功能开展系统研究。针对内质网中含二硫键蛋白的氧化折叠，将重点研究二硫键异构酶家族成员和巯基氧化酶家族成员之间的电子传递途径，解析这两类酶家族中若干重要成员及其复合物的三维晶体结构，揭示这一类重要功能复合物催化蛋白质天然二硫键形成的结构基础；还将研究内质网中的抗氧化蛋白Prx4清除过氧化氢的反应机制，鉴定其潜在的分子伴侣功能，用晶体学和电镜手段研究Prx4发挥作用的结构基础。针对细胞质中的质量控制系统：一方面，将对来源于古细菌的通过水解ATP帮助蛋白质折叠的二型分子伴侣素蛋白开展电镜和晶体学研究，揭示二型分子伴侣素的多种功能态是如何发生精细构象变化的，揭示其底物结合特异性的分子基础及其发挥功能时协同变构的分子机制；另一方面，将研究小热休克蛋白在抑制蛋白质折叠错误和纤维样聚集等过程中的分子机制，重点研究小热休克蛋白对帕金森致病蛋白α-Synuclein淀粉样纤维形成的影响、小热休克蛋白的聚合形式与分子伴侣活力之间的关系及其抑制纤维形成的结构基础。回答这些关键问题将为解释相关的“构象病” 提供重要参考，并为蛋白质重组表达工程在方法学上的突破提供理论依据。 4. 一些重要疾病相关膜蛋白和蛋白质复合物的结构生物学研究 本项研究包括对严重高发性传染病病原体致病关键膜蛋白、蛋白质复合物及内源性疾病致病通路中的蛋白质复合物的结构与功能的研究。在传染病相关方面，重点研究负链RNA病毒（包括流感病毒、流行性出血热病毒和狂犬病毒等）共有的RNA聚合酶的结构，揭示RNA复制机制；研究乙肝病毒表面膜蛋白结构，了解病毒感染与免疫的机制；研究与结核分枝杆菌细胞壁合成相关的多酶复合物及膜蛋白的结构与功能，从原子水平了解结核分枝杆菌细胞壁的合成细节，发现新型抗感染药物的靶点。在内源性疾病方面，疾病的发生与发展常涉及一系列由内源致病因素（如基因缺失、突变）产生的相关基础蛋白及其相互作用形成的功能复合物，对这些重要蛋白质及蛋白质复合物的结构与功能的研究是揭示内源性疾病发生与发展分子机理的关键，而且是相关诊治策略制定和药物研发的重要基础。本项目将研究最近鉴定的一类与内源性脑海绵状血管瘤（CCM）和神经母细胞瘤（NB）直接相关的蛋白质复合物CCM1、2、3和CCM2-TrkA的结构与功能，揭示疾病发生与发展的蛋白质结构基础。 二、预期目标 本项目的总体目标： 解析一批与重要生命活动密切相关的膜蛋白和蛋白质复合物的三维结构，包括细胞信号传导和线粒体能量代谢的关键膜蛋白、基因损伤修复中的关键复合物、蛋白质折叠中的折叠酶和分子伴侣及传染性疾病和内源性神经系统疾病致病相关的重要膜蛋白和蛋白质复合物，将对这些重要生命活动的认识推进到以膜蛋白和蛋白质复合物结构为基础的更接近其本质状态的新层次，进而对阐明线粒体呼吸链电子传递和质子泵机制、GPCR跨膜信号传导分子机制、基因损伤修复机制及折叠酶和分子伴侣帮助下的蛋白质折叠原理做出重要贡献，推动我国结构生物学研究进入世界先进行列。对严重高发性传染病病原体（如流感、乙肝和结核病）和内源性神经系统相关疾病的结构生物学研究取得突破性结果，对RNA负染病毒的复制机理、肝炎病毒的免疫调控机制及内源性神经细胞瘤的致病机理获得深入了解，从而提出有效的防治策略和有针对性的自主药物研发，为促进我国人口健康水平做出基础性和前瞻性贡献。 五年预期目标: 1.解析2-3个膜蛋白和20-25个重要功能蛋白及其复合物的三维结构，在研究GPCR介导的信号传导通路、线粒体呼吸链电子传递机制、基因损伤修复机理、分子伴侣辅助的蛋白质折叠及传染病病原体和内源神经系统相关疾病致病机理研究取得重要进展。 2.培养一批在膜蛋白与蛋白质复合体研究领域具有国际竞争力的优秀中青年科学家和后备人才，造就一支结构合理、具备一定攻坚能力的国际先进水平的研究队伍，建设膜蛋白与蛋白质复合体研究的国际一流水平的研究基地。 3.在现有工作的基础上，建立完善的膜蛋白与蛋白质复合体功能与结构研究的技术平台体系，重点加强膜蛋白与蛋白质复合体的制备体系，建立多种结晶技术，进一步发展膜蛋白与蛋白质复合体X-射线晶体衍射、低温电镜结构解析技术，力争实现若干关键技术的自主创新。 4.研究成果主要以研究论文和自主开发的技术成果（专利）形式公布，在重要学术刊物上发表学术论文30-50篇，力争在具有高影响力的科学期刊（如Cell, Nature及Science）上发表论文。 |
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purpleboy623
木虫 (正式写手)
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续
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三、研究方案 1）学术思路： 本项目重点选择一些具有重要生物学意义、与重大疾病的发生和发展相关的生物学体系为研究对象，综合应用结构生物学的研究手段，解析若干关键膜蛋白和蛋白质复合物的三维结构，揭示重要生命活动的分子机理，为相关疾病的防治和药物研发提供新原理、新方向，这是总体的研究思路。特别重视膜蛋白和蛋白质复合物的结构与功能研究的有机结合，在精确分子结构的基础上揭示生命活动的本质。大力发展新技术和新方法，综合运用X-射线晶体衍射法和低温电镜方法攻克膜蛋白和蛋白质复合物结构解析的世界性难题。 项目的研究骨干来自于生物物理研究所的生物大分子国家重点实验室。围绕总体战略目标，项目设置4个课题。项目的执行采用首席科学家负责制，如项目获准，首席科学家将充分发挥课题负责人和学术带头人的骨干作用，采用学科交叉、分工合作的方式来实施研究计划。同时，首席科学家还将在有关部门的领导下，根据国家规定，通过项目专家委员会，采用激励和滚动机制对项目进行管理，保证研究计划的稳步实施。 2）技术途径： 由于膜蛋白和蛋白质复合体的多样性和高度复杂性，单一的技术和方法很难成为普遍适用的手段用于得到完整的结构和功能信息。因此，本项目将整合多种技术手段和方法，从结构基础和功能机制两方面对各课题所涉及的膜蛋白和蛋白质复合体进行研究，并在实践中探索适合多种膜蛋白和蛋白质复合体研究的新思路和新方法。 1. 膜蛋白的纯化和结晶：构建高效表达体系和建立特殊结晶方法 与水溶性蛋白质相比，膜蛋白的结构研究难点在于：内在膜蛋白的天然含量很低，需要通过重组表达来获得结构研究及后续功能研究所需的样品；内在膜蛋白的分离纯化也有很大的难度，一般需使用较剧烈的条件（如去污剂、有机溶剂和超声波等）才能将其由生物膜中溶解下来，分离后一旦将去污剂或有机溶剂除去，蛋白样品极易凝聚；内在膜蛋白晶体生长十分困难，主要是因为内在膜蛋白在天然膜中的相互作用通常是依靠疏水力来维持，因而不具备结晶所需的大规模亲水表面；由于与结晶困难相类似的原因，膜蛋白晶体常常衍射能力比较弱，晶体优化相当困难。 在以上瓶颈技术中，膜蛋白的规模化表达处于整个技术路线的起点。将主要依靠重组表达解决膜蛋白的样品来源问题。由于膜蛋白异源重组表达对于本项目的成败至关重要，需周密的计划以应对各种可能的困难。在使用大肠杆菌表达膜蛋白时常会遇到如下困难：稀有密码子引起的低表达、大量表达的异源蛋白对宿主细胞产生的毒性、mRNA 5’端二级结构对蛋白翻译起始的抑制作用、包涵体及重组蛋白的不稳定性等。类似的问题在其它异源表达系统中也会出现。我们已建立起一套应对这些问题的技术路线。此外，计划利用研究所蛋白表达纯化及结晶技术平台，高效构建膜蛋白在大肠杆菌、酵母和昆虫杆状病毒等多种细胞中的表达体系，高通量筛选并获得膜蛋白的最佳表达条件，以期获得用于蛋白质晶体生长等研究需要的毫克级别蛋白样品。对于公认的极难表达的膜蛋白（如GPCR），拟建立并优化人工进化、盒式突变、DNA洗牌法等多种突变库技术，通过与高通量筛选技术（如流式细胞仪、菌落过滤）的结合，以期通过有限的点突变改善膜蛋白的可表达性、稳定性和可溶性。 在样品纯化过程中，除充分应用现代蛋白质科学成熟的多种层析技术外，还将利用新型高通量蛋白热稳定性测量技术（如热变性荧光法）快速、高效地寻找更适合膜蛋白稳定性的去污剂和缓冲液体系组合，发展高通量技术筛选蛋白包涵体的复性技术。 在膜蛋白的结晶筛选中，将利用机械手来进行高通量晶体条件筛选，该系统具有自动化程度高、快速、处理亚微升样品等能力。此外，计划采用在GPCR蛋白结晶中被证明有效的融合蛋白技术及膜蛋白结晶特有的脂立方相及脂海绵相等结晶方法，以提高膜蛋白结晶的成功率。 2.蛋白复合体的制备：探索稳定和批量的技术路径 大型蛋白质复合体的制备是有关其结构与功能研究的关键之一。本项目涉及的蛋白质复合体将以天然材料分离和重组表达两种方式进行。天然分离的优势在于容易得到稳定的复合体，并可能直接适用于低温电镜等研究技术；其缺点在于一般复合体含量较低，且分离步骤较为复杂。重组表达的方法则在产量上一般有着天然来源难与匹敌的优势，但蛋白质复合体中的蛋白分开表达时常常容易形成非特异性的聚集体。因此，根据技术路线的相对容易程度，如果所选蛋白质复合体在天然材料中含量较为丰富，则采取天然纯化方法予以富集，还可通过诱导生物体或组织大量产生目标蛋白质复合体以提高产量。对于天然含量极低的蛋白质复合体，则必须使用重组表达的方法进行。需要强调的一点是，重组蛋白可以使基于突变方法的结构与功能的研究变得较为易行。目前，我们已拥有多种能够同时表达若干不同蛋白质分子的体系（如QLink系统、pETDuet系统等）。蛋白复合物的亚基可在一起表达的同时相互识别结合为复合体，这将大大提高复合体形成的成功率，并已有多个成功的例子。此外，融合蛋白对低亚基数复合体蛋白的异源性表达往往行之有效。 3．三维结构的解析和分析：X射线晶体学技术与低温电镜三维重构技术相结合 X射线晶体学和低温电镜三维重构是本项目进行结构解析的主要研究手段，由于膜蛋白和蛋白质复合体的特殊性，本项研究将充分重视这两种手段的有机结合，突破一些研究瓶颈和难点。 蛋白质晶体结构测定是一门成熟的技术，除采用传统的硒代蛋白反常散射方法和传统的重原子多对同晶置换法解决相位问题之外，对于蛋白质复合体的晶体结构解析，我们将考虑利用电镜三维重构技术获得该复合体的低分辨率结构，并以此作为初始相位，采用非晶体学电子密度平均、过采样相位迭代等技术进行相位扩展，从而有效地克服蛋白质复合体晶体结构解析的困难。 膜蛋白和蛋白质复合体的晶体衍射能力通常比较差，一般只能获得低分辨率（3.5～5埃）的衍射数据，如何在分辨率较低的情况下解析出比较准确和可靠的三维结构是蛋白质晶体研究的新问题。我们将发展新的技术和方法来应对这种情况，如各向异性校正、B－Sharpening、Normal Mode结构修正、多晶平均等技术，这些技术的应用将有效地提高膜蛋白和蛋白质复合体的结构解析准确度，从而更有利于基于结构的功能研究。 电子显微镜在结构生物学中的应用近年来变得越来越重要，成为解析大型蛋白质复合体、病毒乃至细胞器的三维纳米分辨率结构的有力手段，同时电子显微镜二维晶体学在膜蛋白的三维精细结构解析上也有特殊的优势。我们将利用中科院蛋白质科学研究平台的先进的300千伏场发射低温电子显微镜，开展蛋白质复合体的低温单颗粒三维重构研究，在获取膜蛋白二维晶体的基础上对其进行低温电子晶体学结构解析，对细胞内的蛋白质复合体功能态开展低温电子断层三维重构研究，在应用低温电镜获取三维纳米分辨率结构的基础上，结合X射线晶体结构获得蛋白质复合体的准原子模型。此外，整合蓝色非变性电泳（BN-PAGE）技术的低温电镜样品制备方法将对样品量的需求从毫克级下降到微克级，大大降低了蛋白质复合体结构研究的难度。 除了利用X射线晶体学和低温电镜三维重构技术外，我们还将利用中科院蛋白质科学研究平台的先进的高性能计算机系统，在膜蛋白和蛋白质复合体的结构解析基础上，开展它们的分子动力学分析和模拟，预测其动力学行为，从而进行有的放失的功能研究。 4.基于结构的蛋白质功能研究：功能与结构相得益彰 本项目将整合各课题组的研究优势，重视联系精确三维结构开展多层次的蛋白质功能研究：在分子水平，研究蛋白质相互作用的分子机理；在细胞水平，研究蛋白质的亚细胞定位、与其他蛋白的动态相互作用及其对细胞功能的影响；在组织器官水平，研究细胞之间信息交流及其分子基础。生物物理研究所先进的生物成像平台将为这些功能研究提供有力的技术支撑。 3) 创新点与特色： 1.本项目选取的研究体系和生物学问题大多是在项目组成员多年研究基础上提出来的，具有原创性。 2.研究方案充分重视结构与功能研究的密切结合，将进行较全视野的探索。 3.通过创新克服研究、技术上的主要难点。大力发展膜蛋白和蛋白质复合物的重组表达、纯化、晶体生长和结构解析新方法、新技术。在现有技术、理论基础上，综合分子生物学、蛋白质工程和高通量技术，为膜蛋白高效表达、纯化和结晶开辟新的途径；在发展膜蛋白X射线晶体学和膜蛋白二维电子晶体学的基础上，发展新的膜蛋白结构解析方法，加快膜蛋白的结构解析速度。 4）可行性分析： 本项目是在整合中科院生物物理研究所9个研究组的优势研究力量的基础上，通过交叉、融合形成了上述的研究课题。项目组汇聚了三位中科院院士和一批中青年学术带头人，形成了一支老中青相结合的具有雄厚实力的研究队伍。项目组主要成员在相关的研究方向上都有很好的基础，形成了自己的优势及特点。本项目组的主要成员作为研究骨干参加了依托生物物理研究所的“十一五”蛋白质计划基地项目，并做出了重要成绩。项目组成员所在的实验室长期从事相关领域的蛋白质复合体的结构生物学研究工作，先后解析了包括线粒体呼吸链复合体II、SARS病毒的NS7/8复合体结构、PA_C/PB1_N蛋白复合体结构神经营养因子-3与受体复合物结构、细胞周期检查点蛋白Rad9-hus1-rad1三元复合物等。这些复合体既有从生物体直接提取获得的，也有通过重组表达纯化得来的。在不同途径获得可用来结晶分析的复合体研究方面积累了丰富经验。目前，我们可通过使用真核细胞（如酵母细胞、昆虫细胞杆状病毒体系、293细胞等）或原核细胞对复合体蛋白表达纯化，以取得可用于结晶分析的蛋白质，获得了多种与本项研究相关的蛋白质复合体，包括通过综合使用原核及真核系统重组表达获得的超过7种不同亚基的超大复合体以及多种含有3种或3种以上成分的复合体。这些成功经验为本项研究的顺利执行提供了条件支持。本项目依托在具有厚重的历史积淀的生物物理研究所，拥有由中科院投入大量经费建立了强有力的蛋白质科学实验研究平台。以上情况表明，本项目研究具有扎实的研究基础，较丰富的相关研究经验，充分的实验技术和设施支撑条件，从而具有很好的项目实施可行性。 5）各课题间相互关系 围绕项目的关键科学问题，本项目设置四个课题：(1)细胞信号传导和能量代谢相关膜蛋白结构及调控机制的研究；(2)基因损伤修复相关蛋白质复合物的结构与机理研究；(3)蛋白质折叠中折叠酶和分子伴侣的结构与功能研究；(4)一些重要疾病相关膜蛋白和蛋白质复合物的结构生物学研究。这四个课题的主要研究内容反映了复杂生命活动的四个侧面，它们互相联系构成我们对生命活动认识的一个局部系列。通过能量代谢和信号传导获取足够的能量和正确的信息指导是有机体正常生存和活动的必要条件，通过基因损伤修复维持基因组的稳定性是维系正常遗传的保证，在分子伴侣指导下完成多肽链折叠是作为当代生命活动主要基础的蛋白质合成的重要条件，由于异常生理产生疾病是与人体健康直接相关的生命现象的另一种表现。同时，以上四个方面的生物学问题均涉及各自相关的膜蛋白和蛋白质复合物，都需要通过解析它们的三维结构作为揭示机理的基础，这也构成以上课题间的重要内在联系。 四、年度计划 年度 研究内容 预期目标 第 一 年 依靠高通量筛选系统，对各个目的蛋白质的克隆表达纯化条件进行摸索 获得可以稳定高量表达的目的蛋白质 第 二 年 在已经稳定表达目的蛋白的基础上，进行结晶条件的初筛，确定其生理状态下的底物以及配体，开展复合物的装配与制备。 成功制备目的蛋白复合物，获得单个目的蛋白质或复合物晶体。 第 三 年 建立目标蛋白或复合物的生理功能测定方法，并且进行生理功能检测。同时进一步优化目的蛋白质晶体，制备低温电镜样品。 对目的蛋白和复合物的生物学功能进行初步测定及探讨，同时得到高质量的蛋白质晶体，制备低温电镜样品。 第 四 年 利用X射线衍射和低温电镜三维重构技术解析目的蛋白质的三维结构。并对已解析结构的目的蛋白开展相关的功能研究。 完成目的蛋白结构解析。 第 五 年 基于结构，对目的蛋白的结构功能关系进行深入探讨。 深入探讨目的蛋白的三维结构与其所发挥的生物功能的关系，发表论文，尝试科研成果向应用领域的拓展。 |
2楼2010-08-15 21:47:18
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