| 查看: 11803 | 回复: 27 | |||||||||||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | |||||||||||
[交流]
【分享】细胞爬片全过程经验总结 已有26人参与
|
|||||||||||
|
细胞爬片全过程经验总结 细胞爬片的制备是免疫细胞化学、免疫荧光、TUNEL凋亡检测的第一步，也是获得一份漂亮的实验结果的关键步骤。Easylabs站长根据自已多年的经验，奉献此文，希望对大家的实验有所帮助。 【爬片的准备】 1. 爬片可用一般的盖玻片，也可用专用爬片； 2. 应用盖玻片，可根据自己的需要剪裁成合适的大小，以备置于6孔板、12孔板或24孔板；裁剪时可用前护士输液用于打开玻璃安瓶的小沙轮，或者是口腔科的那种小沙轮，轻轻划一下后，稍用力一掰就分开了。 如果接种大皿的话，我一般不将盖玻片切开，直接清洁后放入培养皿中，到染色时再将之切开，这样既保证了细胞均一性，又可同时做几个指标的染色。 3. 将剪裁好的爬片，置于浓硫酸中浸泡并过夜，第二天先用自来水冲洗20遍，再置于无水酒清中浸泡6小时，再用三蒸水冲洗3遍（个人认为主要目的是将酸冲洗干净就可以了，如果不干净的话，细胞帖壁不好），放在饭盒或者玻璃培养皿中烘干后进行高压消毒。 4. 高压后取出放入烤箱中烤干，备用。烤干后可放入超净台中。 5. 关于多聚赖氨酸，很多人都将玻片用此处理，以使细胞与玻片结合更牢。但我在做爬片时从来没用过多聚赖氨酸，细胞贴壁仍然很好，且在做后续的免疫细胞化学染色、TUNEL等凋亡检测、免疫荧光等也从未脱过片。 【细胞爬片】 1. 胰酶消化细胞后计数重悬细胞于完全培养基中。 2. 加细胞时，根据玻片的大小，先在每个孔里准备放爬片的位置滴少量培养基，目的是使玻片与培养皿靠培养基的张力粘合到一起，然后放玻片，防止加细胞悬液时玻片漂起，造成双层细胞贴片。整个过程注意无菌操作。 3. 根据自己的需要选择合适的细胞密度种入培养板内即可 4. 待细胞贴壁后，可去上清加含药培养基。 5. 按照实验设计，作用一定时间后取玻片。取玻片时由于玻片与培养皿底结合较紧，张力较大，我一般将注射器针头针尖向背面弄个小钩，这样将爬片轻轻勾起，用小镊子取出就可以了。如果要做诸如24h，48h，72h等这样时间点的实验的话，将所需数量的爬片取出时应用酒精灯火焰烧一下针头和镊子。末取出的可接着继续培养。 【细胞爬片的固定】 细胞爬片取出后，一般用PBS洗2遍，然后再做固定。当然，根据研究目的，PBS洗也不是一定要做的，比如做凋亡的TUNEL染色时就避免洗，因为凋亡的细胞在洗的过程中有可能会脱落。 另外在保存细胞爬片的时候，我一般用培养皿或板，先在皿底放一层面巾纸，然后再放爬片，这样方便做实验时取片。然后盖上盖子，并在盖子上做标记，为避免混淆，可用透明胶带将盖子和皿连在一起。一般-20℃保存2-3个月的片子做免疫组化是没有问题的。 以下为常用的固定液 1. 冷丙酮 可用于一般的免疫组化染色。 将纯的丙酮预先放入冰箱-20℃后便为冷丙酮（放心，丙酮在此温度不会为固体的）细胞爬片取出后，PBS洗2遍，便可加入冷丙酮于-20℃（丙酮有很强的挥发性，注意将含有丙酮和爬片的器皿盖严，防止其挥发）固定10分钟。取出后，室温吹干，然后放入-20℃保存。 2. 多聚甲醛(常用4%)：可用于免疫电镜；也可用于免疫荧光以及TUNEL染色。 主要检测组织内一些性能娇弱的抗原特别是细胞表面抗原，例如各类淋巴细胸分化决定簇(CD)、主要组织相容性抗原等 室温固定15分钟后，将表面液体吹干，入-20℃保存 3. 95％乙醇，可用于免疫组化。 优点：穿透性强、抗原性保存较好。 缺点：但醇类对低分子蛋白质、多肽及胞浆内蛋白质保存效果较差，使蛋白变性的作用轻，固定后可再溶解；染色过程中，温育时间长，抗原可流失而减弱反应强度 室温固定15分钟后，将表面液体吹干，入-20℃保存 4. 甲醛(福尔马林)应用最广 优点：形态结构保存好，且穿透性强， 缺点： 甲醛放置过久可氧化为甲酸，使溶液pH降低，影响染色； 分子间交联形成的网格结构可能部分或完全掩盖某些抗原决定簇，使之不能充分暴露。可造成假阴性的染色结果。 室温固定15分钟后，将表面液体吹干，入-20℃保存 资料来源： www.yiqi120.com/zlzx.asp |
回复此楼» 收录本帖的淘帖专辑推荐
 优秀资源 | 留学海外 | 细胞生物学实验经验 | Enjoy my life！ |
| 细胞培养 | 细胞实验 | 学习用 | 实验 |
» 本帖已获得的红花（最新10朵）
Cosmiclin» 猜你喜欢
不合理蛙科研实验中的趣事：实验器材的 “乌龙”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验中的趣事：和实验材料的 “斗智斗勇”
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有91人回复
-
蛋白质检测：精准分析，解锁生物分子的密码
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之小鼠实验：严谨设计，解析生命机制的重要载体
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之重金属检测：精准筛查，守护健康与环境的防线
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“蛙测重金属我背锅三千”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“鼠逃三次我发三篇SCI”
已经有0人回复
-
纳米粒度分析
已经有3人回复
-
林科院林化所招收材料与化工专业硕士，坐标南京
已经有0人回复
» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 如何让细胞贴附在多孔疏水材料上
已经有7人回复
- 生物降解生物相容的弹性体（细胞粘附不好）的材料可以做什么材料呢？
已经有3人回复
- 细胞爬片后，能做HE染色吗？
已经有3人回复
- 【经验】毕业答辩必看ppt幻灯片使用总结
已经有53人回复
- 【求助/交流】为什么我的sds-page全细胞总跑成这样，影响看结果，请指点。
已经有16人回复
- 【求助】关于细胞试验
已经有9人回复
- 【分享】细胞培养技术个人总结1
已经有47人回复
- 【原创】细胞培养技术自己的总结
已经有51人回复
- 【求助】细胞凋亡形态学观察 细胞爬片
已经有13人回复
liushuai1122
木虫 (著名写手)
小虫虫
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 11421
- 散金: 15
- 帖子: 1220
- 在线: 72.3小时
- 虫号: 711584
- 注册: 2009-03-01
- 性别: GG
- 专业: 药理学其他科学问题
5楼2010-08-15 11:05:57
liyangmiscap
木虫 (著名写手)
- 应助: 12 (小学生)
- 金币: 5805.9
- 散金: 882
- 红花: 10
- 帖子: 1349
- 在线: 485.2小时
- 虫号: 931189
- 注册: 2009-12-20
- 性别: MM
- 专业: 中药学其他科学问题
2楼2010-08-12 11:54:26
3楼2010-08-12 15:36:24
4楼2010-08-12 16:03:33
