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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【分享】-三磷酸腺苷-答疑专帖，我也来玩~~
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★ ★ ★
看天(金币+2):鼓励 2010-08-13 18:34:13
scelab(金币+2):酶连的事偶也很头疼。。。时间和温度怎么把握令人纠结。。。 2010-08-13 18:53:09
引用回帖:
Originally posted by feiye2214 at 2010-08-11 19:46:46:
问一个迫切的问题，试剂盒上说转化是16度，30min
还说效果不好就直接16度，过夜，我不知道过夜是多长时间
7小时够不够?时间长了是不是会出问题啊？

不是转化，是连接
T4 DNA ligase在4度到室温都有活性
然而，由于连接的时候要考虑黏端互补配对的稳定性，虽然温度高的时候酶活高，但是黏端的互补也容易解链，所以目前的折中方案一般是16度连接5分钟到数小时

按照我的个人经验，如果连接过夜，一般最好是4度连接

过夜一般指超过12h，通常是14~16h
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31楼2010-08-11 21:42:42
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
Originally posted by feiye2214 at 2010-08-11 19:43:48:
楼主做过显微操作么？

没有……膜片钳或者显微注射之类精细活还没做过
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32楼2010-08-11 21:43:22
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yixuanwin

铁杆木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2010-08-11 21:40:07:


我终于明白你的问题了
解决方案：
首先找几个相近物种的跟这段同源的序列出来做比对，发现保守区，然后在保守区那里设计引物，看看能不能钓取到这个未知基因的一部分，然后再继续用其他的方法完整克隆到这个 ...

是这样的。 目前的困难是 不会设计简并引物  保守区的寻找全靠目测。
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33楼2010-08-11 22:00:12
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
Originally posted by yixuanwin at 2010-08-11 22:00:12:



是这样的。 目前的困难是 不会设计简并引物  保守区的寻找全靠目测。

下载DNAman，做序列比对~
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34楼2010-08-11 22:39:49
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PAOs

木虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by PAOs at 2010-08-11 09:32:41:
楼主，有知道测聚磷酸盐激酶的方法吗？

就是测定聚磷酸盐激酶的活性，之前用的方法有种试剂现在Sigma公司不生产了，不知道该怎么办呀
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35楼2010-08-12 11:36:26
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wuwenneng

木虫 (正式写手)
写得这么详细，谢谢分享！
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学会做人！学会做事！
36楼2010-08-12 11:41:29
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
Originally posted by PAOs at 2010-08-12 11:36:26:




就是测定聚磷酸盐激酶的活性，之前用的方法有种试剂现在Sigma公司不生产了，不知道该怎么办呀

论坛下方有个广告，是阿拉丁试剂，据说挺齐全，要不你去看看
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37楼2010-08-12 11:42:04
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云泽紫樱

银虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
我养的293T细胞，前两天出现很多小黑点，就用PBS离心洗了两次，第一次洗时是800rpm，3min，第二次也是800rpm，5min，但是由于离心一次后感觉细胞没有离心下来就又同样转速同样时间离心一次，结果传的4瓶细胞一天后都不怎么贴壁，其中一瓶到第三天开始贴壁，其他3瓶依旧没贴壁的意思，我想请问下是因为离心过多造成的么？谢谢！
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“幸福”就是猫吃鱼，狗吃肉，奥特曼打小怪兽~
38楼2010-08-12 12:27:11
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★ ★
看天(金币+2):鼓励 2010-08-13 18:34:38
amisking(金币+1): 2010-08-15 12:43:08
引用回帖:
Originally posted by 云泽紫樱 at 2010-08-12 12:27:11:
我养的293T细胞，前两天出现很多小黑点，就用PBS离心洗了两次，第一次洗时是800rpm，3min，第二次也是800rpm，5min，但是由于离心一次后感觉细胞没有离心下来就又同样转速同样时间离心一次，结果传的4瓶细胞一天后 ...

细胞越少次离心越好，而且在PBS中待的时间越短越好
下次倘若想洗细胞，可以用培养基来洗
800rpm不算高速，5min时间也不算长
293细胞长得飞快，所以只要有一瓶贴着就行，足够用了我想
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39楼2010-08-12 13:32:14
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★
amisking(金币+1): 2010-08-15 12:43:12
引用回帖:
Originally posted by 云泽紫樱 at 2010-08-12 12:27:11:
我养的293T细胞，前两天出现很多小黑点，就用PBS离心洗了两次，第一次洗时是800rpm，3min，第二次也是800rpm，5min，但是由于离心一次后感觉细胞没有离心下来就又同样转速同样时间离心一次，结果传的4瓶细胞一天后 ...

原来是5分钟离了那么多次，那肯定有损伤的了，
一般离细胞最好都是600~800g，3到5min。用rpm算不大准，只能根据自己离心机的半径来摸条件
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40楼2010-08-12 13:34:04
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