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xhpearl

新虫 (初入文坛)

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[交流] 【求助/交流】PEG修饰度的检测问题，非常需要您的帮助已有5人参与

检测PEG修饰的蛋白的PEG修饰度，结果测出修饰后的游离氨基比修饰前的还多，会是什么原因呢？请各位高手指教一二，现在真是不知道怎么办了，重复了几次，计算出的修饰度都很小，小于10%，接近9，甚至是负值，原因在哪呢？
方法参照：
1.lowry法测定PEG修饰前后蛋白浓度，精密稀释至1mg/ml待用。
2.两种蛋白分别量取0, 40, 80, 120, 200, 300, 400微升于试管内，补加PB缓冲液至1ml。
3.加入PH8.5的NaHCO3缓冲液1ml
4.再加入0.1%TNBS溶液1ml
5.混匀后，40度反应2小时。
6.加入10%SDS溶液1ml,加入1M HCL 0.5ml.
7.测定420nm 下的OD值，绘制曲线。
修饰度=1-修饰蛋白斜率/修饰前蛋白斜率。
对吗？
为什么结果总是不对呢？问题会出在哪里呢？怎么检测分析啊，
非常需要您的帮助，吾将不胜感激！

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1楼2010-08-02 16:15:04

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xhpearl

新虫 (初入文坛)

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您好，谢谢您的关注和热心帮助。
我今天又做了一遍实验，算出的修饰度还是小于零，这次小更多了，成了-50%。修饰度怎么可能是负值呢？真是让人郁闷。
首先我的方法重复性也不是很好，因为样品我用了一样的，可是测出的结果并不一致。但是我操作已经很认真了啊，怎么会差别这么多呢。
修饰后的蛋白已经过过分子筛S200，所以应该不会有残留的PEG了，
修饰前的蛋白也用了7000的透析膜进行了4次透析，还会有问题吗？
lowry法也侧过几次，蛋白浓度相差在可以接受范围内。
那么还有什么是我没考虑到的呢？这个方法还应该怎么改进才对呢？
查文献也查不到几篇，找不到能帮助的资料，所以请各位进行过这种检测的朋友帮帮忙，谢谢您！