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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】最近我的MTT是这样做的，结果很惨
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蜗牛VS蜗牛

捐助贵宾 (著名写手)

[交流] 【求助/交流】最近我的MTT是这样做的，结果很惨 已有4人参与

之前多次做过MTT，结果时好时坏
这次实验是用的耐药细胞株做的MTT
测四种药物对细胞的IC50

第一种：拓扑替康，药物水溶性不是很好，放置十分钟可看到沉淀，但摇动后肉眼观察是均匀的。前面曾经做过，药物的吸光值会对结果影响很大，出现药物浓度越高，吸光值越高的情况。
本次实验：细胞铺板密度5000个每孔，96孔板，24小时后给药，药物浓度设为7个。给药后24小时，我将含药培养液全部吸出，并用PBS洗涤一遍，吸掉PBS后，加入MTT，4小 时后加DMSO测吸光值。
490nm时，明显，还是随药物浓度升高OD值升高，药物浓度很大时（1mg/ml），OD值最高，3点几，4点几了。
570nm时，药物浓度越高OD值越高，但药物浓度很大时（1mg/ml），相对（0.1mg/ml）的OD值也变化不大，都在2点几，接近3。

第二种：表阿霉素，细胞铺板及处理方式均是一样的，也用PBS洗了。
在药物浓度小于（10微克/ml）时，OD值随药物浓度增加而减少，有抑制细胞生长的结果。但在药物浓度增大到100微克/ml以上时，吸光值也开始增加了。如果药物到了1mg/ml。吸光值飚升。

第三种第四种是我们新的药物，看到的结果是反而促进细胞增长。这个很难说。怪我当时没有用显微镜观察下，细胞有没有死。

很着急的，就是做不出点好结果，自己也琢磨不出来。
希望各位指点指点，不胜感激。

[ Last edited by 蜗牛VS蜗牛 on 2010-7-24 at 09:45 ]
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1楼 2010-07-24 09:43:29
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匿名

用户注销 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
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6楼2013-12-10 22:49:21
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★ ★
蜗牛VS蜗牛(金币+5): 2010-07-24 11:21:21
1949stone(金币+3):够朋友 2010-07-24 13:20:22
MTT的吸光度一般以不超过1或者1.2为宜，过头了就是不准的了。可以试试低一点细胞密度，如1000个细胞。另外就是加DMSO的时候加多一点，比如200ul/孔

细胞数的控制其实也要根据细胞的个头来确定的。一般药物处理24h的话，可以在种板的时候控制给药当天细胞密度大概在50%左右即可。细胞太密堆起来的话，做什么实验都不准确

如果你的药物跟MTT之间没有什么交互作用的话，不要用PBS洗了，因为96孔板很容易吸掉细胞，又引入误差。

MTT实验总之就是一个细致，包括从种细胞开始，记得将误差平均分到每个组每个复孔，比如种组1的第一个，组2的第一个，组3的第一个……组1的第二个……还有就是在种的过程中不断摇晃要接种的细胞悬液，保证均匀。96孔种下去的细胞不要摇，因为这种小孔板一摇细胞就容易堆在一起不均匀。

另外就是换液的操作枪头不要戳到板底，最后一步加DMSO前的弃上清也要特别小心，我们是用负压很小心来吸的，用枪头万一用力过猛就把一片结晶吸走了


接lz站内信，上来回复~~~~
还是论坛交流吧
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2楼2010-07-24 10:06:40
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蜗牛VS蜗牛

捐助贵宾 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2010-07-24 10:06:40:
MTT的吸光度一般以不超过1或者1.2为宜，过头了就是不准的了。可以试试低一点细胞密度，如1000个细胞。另外就是加DMSO的时候加多一点，比如200ul/孔

细胞数的控制其实也要根据细胞的个头来确定的。一般药物处理 ...

嗯，谢谢
我的空白组吸光值在0.4左右，单看空白还是不错，其它的本来是抑制细胞生长的，然而吸光值反而高起来了。
只是其它的数据太让人奇怪了，用PBS洗是没有办法的事，药物明显有干扰
别人做拓扑替康我真怀疑
表阿霉素浓度低时还是觉得不错，吸光值0.1到0.4都有，可高时又飙升到很高甚至5以后了。
你说的枪头不能触板底，这个细节我还是没有注意的，我轻轻触了。但从空白组看，影响不大。你再看看我的问题吧
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3楼2010-07-24 11:20:59
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★
lstt09nk(金币+2):很热心~ 2010-07-24 12:24:47
蜗牛VS蜗牛(金币+5): 2010-09-18 09:04:42
我觉得你还是先重新按照恰当的细胞密度来做实验再看看情况吧
96孔里头5000个细胞在我印象中就是很密很密的了

另外的话，如果觉得MTT不稳定，试试CCK-8之类的吧
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4楼2010-07-24 11:24:31
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