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zhuifeng7000至尊木虫 (著名写手)
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[交流]
【求助/交流】原核生物膜蛋白的提取 已有2人参与
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| 求助：想提取原核生物的膜蛋白（最好是革兰氏阳性、厌氧的微生物），想问一下提取的原理、注意事项及提取的protocol，谢谢大家！ |
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amisking(金币+5):good！ 2010-05-12 08:14:24
zhuifeng7000(金币+10):谢谢！ 2010-05-12 23:20:05
amisking(金币+5):good！ 2010-05-12 08:14:24
zhuifeng7000(金币+10):谢谢！ 2010-05-12 23:20:05
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从新鲜样品中提取疏水性膜蛋白（Triton X-114去污剂法） 1、配制疏水性蛋白提取液（非裂解液）：1% Triton X-114，150mM NaCl, 10mM Tris-HCl，1mM EDTA，调pH值至8.0备用。 2、菌液于4℃条件下15000g离心15min收集菌体；用1ml 含有5mM MgCl2 的PBS洗涤3次，最后于4℃条件下15000g离心15min收集菌体。 3、菌体沉淀加入1ml冷提取液，于4℃条件下放置2h，17000g离心10min，去除沉淀取上清。 4、将上述上清中的Triton X-114含量增加到2%，再加入20mM的CaCl2抑制部分蛋白酶活性，37℃条件下放置10min使其分层。室温下1000g离心10min使液相和去污相充分分层。 5、将液相和去污相分开，分别用10倍体积的冷丙酮在冰上沉淀45min。 6、于4℃条件下17000g离心30min，用去离子水洗涤沉淀3次。 7、将沉淀溶解在1% SDS溶液中，测定蛋白浓度，比较液相和去污相中蛋白提取效率，一般是去污相中疏水性膜蛋白较多，适于进一步蛋白实验。 8、SDS-PAGE进一步分析液相和去污相的蛋白图谱。 |
2楼2010-05-12 07:58:24
linglan2612
金虫 (正式写手)
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- 专业: 生物防治
3楼2010-05-12 09:25:45