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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】酶切问题求助！！！
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qianggene

铜虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】酶切问题求助！！！ 已有10人参与

各位虫友，小妹有一问题请教，我最近酶切质粒（PMD-18T)总是切的相当不好，不是切不开，而是切开的目的带特别弱，但质粒很亮，是我加的质粒浓度太高了吗，但我保证加的量是小于1微克。我用的酶是ASCI和NCOI，请高手指点，不胜感激！
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1楼 2010-05-11 20:13:16
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zjzz

木虫 (正式写手)

在通往变态的坦途上
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
商品化的酶50ul两种各家1ul已经很多了。
楼主主要还是要明白质粒本身和目的片段之间的长度比是多少，如果完全切开亮度比是多少？如果没有双酶切，单酶切的条带又占了多少？
明白了这些问题再给酶切的效率下个片段，做一次克隆，我一般都是800ng左右的20ul切开做胶回收，目的片段回收完后的浓度一般很低，在25ng/ul左右，但取个6ul做酶连转化也很够了
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终于熬成木虫了……
12楼2010-05-13 03:09:29
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lingn

木虫 (正式写手)
★ ★
amisking(金币+2):good！ 2010-05-11 20:39:10
qianggene(金币+1): 2010-05-12 14:53:57
首先，质粒的纯度很重要，如果质粒提的不好，含有太多的蛋白是会影响酶切效果的。
可以适当的放大体系，延长酶切时间，或者多加点酶。
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2楼2010-05-11 20:31:11
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen
★
amisking(金币+1):good！ 2010-05-13 08:01:01
不知道楼主提完质粒有没有纯化一下~
还有就是酶切的话按照黄金比例添加就行了~
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Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
3楼2010-05-11 21:19:00
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷
qianggene(金币+1): 2010-05-12 14:53:47
不知道楼主目的片段是多大？可能目的条带与载体大小太悬殊了。如果这样，等摩尔情况下，即使全部切开，目的条带也很弱。
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Thank-you，so-blue.
4楼2010-05-11 21:25:05
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