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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】【求助】有没有做过pfu和rTaq一起使用的
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humants

金虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】【求助】有没有做过pfu和rTaq一起使用的 已有14人参与

最近在做PCR，目的基因大小为1kb。用rTaq扩增效果很好，但是发生突变，我最终的产物是用来表达，测定生物活性的所以要求没有突变。后来就买了promega的pfu但是不论怎么探索就是P不出来，500多元买的东西，眼见就没了，兄弟我急啊。所以打算退而求其次，将pfu和rTaq混合起来用，但是不知道以下内容：
1：二者的配比是多少？
2：两个混合到一起，用谁的buffer？
3：退火温度是迁就rTaq还是pfu？


谢谢大家～～～
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1楼 2010-05-06 16:27:21
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695

木虫 (职业作家)
★
humants(金币+1):谢谢参与
呵呵，1/16或者20%都可以的，退不需要调整什么，就是延伸最好按照pfu的设置
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3楼2010-05-06 16:38:53
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lingn

木虫 (正式写手)
★
humants(金币+1):谢谢参与
1：1混就好，用PFU的buffer，退火温度有区别吗？
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2楼2010-05-06 16:32:41
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蓝粉笔

铁虫 (初入文坛)
★ ★
humants(金币+1):谢谢参与
scelab(金币+1):鼓励新虫！欢迎多来交流！:tiger06: 2010-05-06 22:52:21
那种酶保真效果更好呢？我也在纠结这个问题，一个碱基错了就得重来了，很郁闷。或者有什么方法可以提高酶的保真性呢？是优化Mg还是dNTP或是温度？
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4楼2010-05-06 16:46:21
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yujiaping1

木虫 (著名写手)
★ ★
humants(金币+1):谢谢参与
scelab(金币+1):欢迎多来交流！:tiger06: 2010-05-06 22:52:28
我建议楼主买个宝生物的EX Taq，比普通rtaq保真性高很多，错配很少，又不像PFU条件那么苛刻，极容易扩增出来，价格也没那么贵。而且末端带“A”，可以直接连进载体，比PFU省劲多了
赞一下(2人) 回复此楼
5楼2010-05-06 18:03:36
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