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humants

金虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】【求助】有没有做过pfu和rTaq一起使用的 已有14人参与

最近在做PCR,目的基因大小为1kb。用rTaq扩增效果很好,但是发生突变,我最终的产物是用来表达,测定生物活性的所以要求没有突变。后来就买了promega的pfu但是不论怎么探索就是P不出来,500多元买的东西,眼见就没了,兄弟我急啊。所以打算退而求其次,将pfu和rTaq混合起来用,但是不知道以下内容:
1:二者的配比是多少?
2:两个混合到一起,用谁的buffer?
3:退火温度是迁就rTaq还是pfu?


谢谢大家~~~
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695

木虫 (职业作家)


humants(金币+1):谢谢参与
呵呵,1/16或者20%都可以的,退不需要调整什么,就是延伸最好按照pfu的设置
3楼2010-05-06 16:38:53
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lingn

木虫 (正式写手)


humants(金币+1):谢谢参与
1:1混就好,用PFU的buffer,退火温度有区别吗?
2楼2010-05-06 16:32:41
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蓝粉笔

铁虫 (初入文坛)

★ ★
humants(金币+1):谢谢参与
scelab(金币+1):鼓励新虫!欢迎多来交流!:tiger06: 2010-05-06 22:52:21
那种酶保真效果更好呢?我也在纠结这个问题,一个碱基错了就得重来了,很郁闷。或者有什么方法可以提高酶的保真性呢?是优化Mg还是dNTP或是温度?
4楼2010-05-06 16:46:21
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yujiaping1

木虫 (著名写手)

★ ★
humants(金币+1):谢谢参与
scelab(金币+1):欢迎多来交流!:tiger06: 2010-05-06 22:52:28
我建议楼主买个宝生物的EX Taq,比普通rtaq保真性高很多,错配很少,又不像PFU条件那么苛刻,极容易扩增出来,价格也没那么贵。而且末端带“A”,可以直接连进载体,比PFU省劲多了
5楼2010-05-06 18:03:36
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