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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】继续连接问题
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j2

木虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】继续连接问题 已有8人参与

我用宝生物的连接试剂盒中solution1进行载体和基因的连接，pmol比在1：5的样子，连接3小时，由于其说明书上说连接产物可直接电泳，我取了5ul进行了电泳，发现原载体3600bp，基因2000bp处无条带，在5000bp以下出现了弥散带。不知道是怎么回事？
之前的转化也没筛到阳性克隆。很困惑~~~想请教高手，该怎么办？

marker:7000，5000，3500，2000，1000，500
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修炼ｉｎｇ，当虫仙……
1楼 2010-04-22 14:18:39
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pwj

银虫 (小有名气)
我感觉还是连接完了做转化好点！
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2楼2010-04-22 17:30:06
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j2

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by pwj at 2010-04-22 17:30:06:
我感觉还是连接完了做转化好点！

就是转化没结果，我不知道什么原因，就直接拿连接液电泳看看，结果就这个样子，很苦恼啊~
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修炼ｉｎｇ，当虫仙……
3楼2010-04-22 18:21:14
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lij2
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
4楼2010-04-23 19:50:25
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zjzz

木虫 (正式写手)

在通往变态的坦途上
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
强烈建议你先把原载体和目的基因先电泳检测一下！
你每次回收完片段都检测了吗？不要以为理所当然是好的
有时候不尽然
赞一下(2人) 回复此楼
终于熬成木虫了……
5楼2010-04-24 07:05:46
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螺旋技术

新虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
属于正常现象。
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6楼2010-04-24 11:45:08
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j2

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by 螺旋技术 at 2010-04-24 11:45:08:
属于正常现象。

正常现象是指连上还是没连上啊？
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修炼ｉｎｇ，当虫仙……
7楼2010-04-24 12:28:37
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露露sw

新虫 (初入文坛)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
1949stone: 记得关注啊 2011-09-19 19:25:31
我也是同样的问题啊？
赞一下(2人) 回复此楼
加油！忙碌的工作者们！
8楼2011-09-19 15:17:29
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另一个天堂

金虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
1949stone(MolEPI+1): 不错 2011-09-19 19:25:19
1.建议延长连接时间，我一般过夜（12h）
2.把原载体DNA验证一下，看有没有
3.仔细检查每一步实验
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9楼2011-09-19 18:02:49
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
1949stone(MolEPI+1): 来也 2011-09-19 19:25:04
像你这种连接产物直接电泳其实也可以，但是并不是完全可靠的。。。
按照你图中的图和你所描述的，有可能是连接上了！因为重组载体一般比线性的要小一些；
你可以将连接产物转化一下，这样质粒拷贝数就会很高，然后提取质粒酶切验证，也比较利于你进行连接验证。。。。
祝好运！

[ Last edited by 天使托 on 2011-9-19 at 19:05 ]
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Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
10楼2011-09-19 19:04:07
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