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【求助/交流】求助二次PCR问题 已有1人参与
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最近小弟通过RT-PCR扩增我的目的片段1.5kb并进行测序，由于该基因低丰度表达,量很少，但克隆前提又不能扩增大于30个循环。所以用了半巢式pcr来做，但二次pcr后扩增的结果是拖尾严重，有不少非特异性扩增，能看到目的片段但也很弱，而且浓度稀释后的都差不多（1，1/10, 1/50,1/100）.1/100稀释后后什么都没有了。 请问有谁能告诉我如何优化吗？拖尾的问题如何解决？还有如何这样直接切胶会影响后续的基因重组吗》？谢谢！ |
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