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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】构建载体出现的问题，请各位高手给予帮助
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runxiaoli

木虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】构建载体出现的问题，请各位高手给予帮助 已有8人参与

各位大侠：
   大家好，我最近在做载体构建，经过连接转化后挑菌，进行菌液PCR，对跑出目的条带的菌液进行质粒提取，并进行质粒PCR，也有带。可是进行双酶切的时候出现问题，所有的质粒酶切后经电泳检测皆只有一条带，无目的条带。送出菌液测序，无信号。
  该载体构建实验持续2个月，期间换了好几次载体与目的片段的连接比例，都是遇到以上的情况，深切期待大家的帮忙，不胜感激。期待您的帮助。
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1楼 2010-04-14 19:59:34
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

saturn100

木虫 (正式写手)
★ ★ ★
scelab(金币+3):欢迎多来交流！:tiger06: 2010-04-15 11:55
runxiaoli(金币+1): 2010-04-15 20:54
runxiaoli(金币+1):你好，我用一个载体上的引物与我的下游引物进行质粒pcr，结果跑出的目的条带大小一致。酶切依然无结果。您觉得这种情况应该怎么办。 2010-04-15 20:55
检测目的片段的时候尽量不要用PCR，污染几率太高，而且就算你获得片段了，你没有测序，如何确认你的PCR产物就是目的片段，

双酶切一般比较可靠，不过之后也要进行测序的，你的结果只能说明一个问题，没有目的片段的插入，

重新换个连接酶（好的试剂盒）试试吧！
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2楼2010-04-14 20:20:30
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普通回帖

yujiaping1

木虫 (著名写手)
★
scelab(金币+1):欢迎多来交流！:tiger06: 2010-04-15 11:55
runxiaoli(金币+1):我的目的片段为800多bp,做了好几次出现的结果就是这样。又用载体上的引物与我的下游引物进行质粒pcr，结果跑出目的大小的片段。不知道这能不能说明已经连接上了。 2010-04-15 20:56
我也觉得酶切结果很可靠，说明你没有连进去，只能选择更好更适合的载体，是不是你的目的片段太大，不好连
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3楼2010-04-14 20:24:25
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beisimai895

木虫 (小有名气)
★
scelab(金币+1): 2010-04-15 11:56
你可以看以下切除的一条带是多大，就知道有没有包含目地基因了，如果条带的大小没有变化，说明没有目的片段连进去。
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4楼2010-04-15 11:07:27
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goodwish

木虫 (正式写手)

木虫书呆子
★
scelab(金币+1): 2010-04-15 11:56
runxiaoli(金币+1):我送菌液出去测序的，因为载体是经过改造过的，所以我把我的目的片段的上下游引物都发给测序公司了。无信号，然后又用载体上的引物与我的下游引物进行质粒pcr，结果跑出目的大小的片段。不知道这能不能说明已经连接上了 2010-04-15 20:59
测序无信号是什么意思？质粒上的序列也测不出来吗？是不是你用的载体有问题？
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生命的海洋里，我是蓝色的一滴
5楼2010-04-15 11:38:18
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陈容

不可能连菌液测序信号都没有啊，是不是你用于酶切的没错了
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6楼2010-04-15 12:23:05
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liyong1981

金虫 (正式写手)
runxiaoli(金币+1):我做过双酶切，载体没有问题。我用的是在引物上加酶切位点的方法做的。 2010-04-15 20:58
你酶切位点在原来载体上还有么？我意思是，你的模板有问题没有？你要先做好几种酶切，确保你的载体没有问题，
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7楼2010-04-15 16:17:22
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
测序没信号就换家公司吧~~可能他们真的很差劲
如果测了是空，那就是空~

另外，菌液PCR的假阳性是很高的
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8楼2010-04-15 18:34:44
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saturn100

木虫 (正式写手)
如果你认为你的pcr产物是对的，那你就把它也送去测序，然后你就知道结果如何了，
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9楼2010-04-15 22:06:05
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goodwish

木虫 (正式写手)

木虫书呆子
★ ★ ★
scelab(金币+3):high hand~ :tiger23: 2010-04-18 01:41
runxiaoli(金币+1):非常感谢，不胜感激。 2010-04-18 19:11
提供几个思路：
1.PCR时做对照，对空载体也PCR看看。
2.用载体自带的上下游引物做一下PCR看看。
3.看看你的片段上本身有没有其他酶切位点，切一下看看（要用空载体作对照）。
4.测序无信号说明菌液可能有污染，重新挑取单克隆鉴定、测序。
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生命的海洋里，我是蓝色的一滴
10楼2010-04-17 23:36:16
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