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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】如何设计兼并引物
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zhlzuo

新虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】如何设计兼并引物 已有3人参与

各位大虾：
    小弟想根据不同昆虫中表达相同蛋白的DNA序列设计一对兼并引物，已知的这些目的基因有些知道全长，有些只知道一部分序列，我怎样去根据这些已知的信息去设计引物，然后再特异扩增另一种昆虫体内的相似的目的基因呢？
    由于我是新手，很多东西不懂，请各位多多指教，谢谢。
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ZHL
1楼 2010-03-30 23:15:23
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yujiaping1

木虫 (著名写手)
zhlzuo(金币+1):我要做的是前者，多谢指教。 2010-04-01 21:22
你的目的是什么，获得某个在其他昆虫中已知而在你研究的昆虫中未知的基因的全长？还是研究某个基因在不同昆虫中的表达？
如果是前者，那么就设计RACE同源引物（设计方法同后面，只是引物长度和退火温度根据试剂盒还有特殊要求），然后PCR克隆测序
如果是后者，就设计一对同源引物，测序后，重新设计RT-realtime PCR，进行定量分析。

具体简并引物的设计方法，你要看比对结果，比如你的昆虫和已知该基因的昆虫基因相似度很高，在90%左右了，那么就可以根据比对结果在保守区直接设计引物，不需要简并碱基，如果相似度相对低，那么你就根据比对结果在保守区设计简并引物，简并碱基是根据不同昆虫比对的结果设计的，还可以根据密码子的偏好，降低简并度，一般来说简并度不能超过16，如果太高，可以用黄嘌呤代替简并碱基，因为它可以很好的跟四种碱基配对

[ Last edited by yujiaping1 on 2010-3-31 at 09:21 ]
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2楼2010-03-31 09:19:56
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anny66cb

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by yujiaping1 at 2010-03-31 09:19:56:
你的目的是什么，获得某个在其他昆虫中已知而在你研究的昆虫中未知的基因的全长？还是研究某个基因在不同昆虫中的表达？
如果是前者，那么就设计RACE同源引物（设计方法同后面，只是引物长度和退火温度根据试剂盒 ...

“你的昆虫和已知该基因的昆虫基因相似度很高，在90%左右了，那么就可以根据比对结果在保守区直接设计引物“”

这里的相似度很高，90%左右是指的什么？ 是核苷酸序列比对结果吗
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3楼2010-03-31 09:43:02
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yujiaping1

木虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by anny66cb at 2010-03-31 09:43:02:



“你的昆虫和已知该基因的昆虫基因相似度很高，在90%左右了，那么就可以根据比对结果在保守区直接设计引物“”

这里的相似度很高，90%左右是指的什么？ 是核苷酸序列比对结果吗

就是说你的基因可能在是未知的，但是其他基因在你的物种和你所比对的物种，一般同源性都比较高。比如，我是做对虾的，我做中国对虾和凡纳滨对虾，我是根据黑虎虾的序列设计的引物，我比对了中国对虾和黑虎虾的很多基因，发现同源性都在90%左右，相似度很高，于是我设计引物的时候，就没有设计简并序列，发现不简并的引物比简并引物容易做得多
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4楼2010-03-31 11:27:39
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hc1027

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by yujiaping1 at 2010-03-31 11:27:39:


就是说你的基因可能在是未知的，但是其他基因在你的物种和你所比对的物种，一般同源性都比较高。比如，我是做对虾的，我做中国对虾和凡纳滨对虾，我是根据黑虎虾的序列设计的引物，我比对了中国对虾和黑虎虾的 ...

请问设计的简并引物可用于实时荧光定量吗？
要使定量准确的话，要注意些什么？是不是要求特异性很好？
对于简并引物，染料法和探针法都可以吗？谢谢
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5楼2010-04-05 12:04:25
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DNAhelix

银虫 (著名写手)
zhlzuo(金币+1): 2010-04-11 20:44
方法1：通过比对找到该蛋白的保守系列，直接设计引物。
方法2：你能确定该蛋白的某些氨基酸系列，选择简并性密码子数少的氨基酸设计其简并性引物。
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智慧活法：不生气，不计较！
6楼2010-04-05 13:43:04
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yujiaping1

木虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by hc1027 at 2010-04-05 12:04:25:

请问设计的简并引物可用于实时荧光定量吗？
要使定量准确的话，要注意些什么？是不是要求特异性很好？
对于简并引物，染料法和探针法都可以吗？谢谢

定量PCR是可以使用简并引物的，尤其是使用探针法的时候，引物简并没有问题，甚至探针也可以在突变位点设置简并，以便即使突变也可检测到。但是染料法就没有那么好的适用性，因为简并引物很多情况下很难跑出单一条带，就是说特异性不够好，那么就不适用于染料法，当然如果检测结果证明简并引物的PCR产物是单一的，那么这对简并引物用于染料法也是合理的
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7楼2010-04-05 19:04:33
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