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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】PCR一个2.1KB左右的片段出现了问题
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维纳斯的骑士

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】PCR一个2.1KB左右的片段出现了问题

最近从啤酒酵母基因组里扩增一个2.1KB左右的片段，用pyrobest，EX taq，primestar等DNA聚合酶都试过 了，只有EX taq能扩出来一点目的条带，下面是我的PCR体系：ddH2O 33.5uL，10Xbuffer 5uL，dNTP 4uL，MgCl2 4uL，
Template 0.5uL， N-prime 1uL，C-prime 1uL，EX taq enzyme 1uL，总共50uL，
请教大家了！谢谢
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1楼 2010-03-16 03:46:21
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维纳斯的骑士

金虫 (小有名气)
★
1949stone(金币+1): 2010-03-16 12:28
不好意思，忘记说反应条件了，呵呵
退火温度44度，反应40秒
72度延伸2分半钟
反应35个循环
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2楼2010-03-16 03:50:26
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yujiaping1

木虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
taq酶加的好多啊，太浪费了，0.25就够了，适当多一点，到加倍足以
至于条带弱，可能跟模板有关系，另外觉得引物的退火温度很低了，是不是特异性不够好啊
建议增大模板量试试，另外可以考虑适当加大镁离子用量，还是不行，可以二次PCR
这些方法都不行，就只能换引物了，这是最可靠的
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3楼2010-03-16 13:06:17
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cascc

铜虫 (小有名气)
首先保证酵母基因组的质量，加点DMSO在反应体系中，如果想用高保真酶，建议使用KOD-plus。
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4楼2010-03-17 20:47:03
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