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维纳斯的骑士

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】PCR一个2.1KB左右的片段出现了问题

最近从啤酒酵母基因组里扩增一个2.1KB左右的片段,用pyrobest,EX taq,primestar等DNA聚合酶都试过 了,只有EX taq能扩出来一点目的条带,下面是我的PCR体系:ddH2O 33.5uL,10Xbuffer 5uL,dNTP 4uL,MgCl2 4uL,
Template 0.5uL, N-prime 1uL,C-prime 1uL,EX taq enzyme 1uL,总共50uL,
请教大家了!谢谢
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cascc

铜虫 (小有名气)

首先保证酵母基因组的质量,加点DMSO在反应体系中,如果想用高保真酶,建议使用KOD-plus。
4楼2010-03-17 20:47:03
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维纳斯的骑士

金虫 (小有名气)


1949stone(金币+1): 2010-03-16 12:28
不好意思,忘记说反应条件了,呵呵
退火温度44度,反应40秒
72度延伸2分半钟
反应35个循环
2楼2010-03-16 03:50:26
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yujiaping1

木虫 (著名写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
taq酶加的好多啊,太浪费了,0.25就够了,适当多一点,到加倍足以
至于条带弱,可能跟模板有关系,另外觉得引物的退火温度很低了,是不是特异性不够好啊
建议增大模板量试试,另外可以考虑适当加大镁离子用量,还是不行,可以二次PCR
这些方法都不行,就只能换引物了,这是最可靠的
3楼2010-03-16 13:06:17
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