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acaifeng

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Originally posted by 十二1130 at 2010-03-31 14:25:29:
我也遇到了同样的问题，双酶切之后目的条带根本就看不到

载体和片段差异较大时有可能会出现这样的结果

21楼2010-03-31 14:39:32

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十二1130

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引用回帖:

Originally posted by acaifeng at 2010-03-31 14:39:32:

载体和片段差异较大时有可能会出现这样的结果

我的载体是片段大小的13倍，这个算差异很大么

22楼2010-03-31 14:56:23

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wbfree

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huangdi07(金币+1):谢谢参与

酶切之后最好测序一下，看是否连上了，这样后续工作也好做

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23楼2010-03-31 15:03:41

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shenyangph

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huangdi07(金币+1):谢谢参与

外行人
帮顶

24楼2010-04-02 22:40:02

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huangdi07

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[quote]Originally posted by j2 at 2010-03-30 15:12:25:
如果2段差别很大，一般的电泳看不出来也正常吧
如果只是点突变的话，酶切位点还是可能识别的~ [/quo

感谢您的回答问题是我现在测序出来了序列是正确的 Hind III酶切位点突变了但是为什么用Hind III单酶切时还是可以切开啊

25楼2010-04-05 15:18:58

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huangdi07

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引用回帖:

Originally posted by hui_student at 2010-03-30 15:40:46:
哎，辛苦楼主了，想的检测方法不少，你的问题和我以前遇到的一样。或许你找问题的地方不对··
当时我的情况是这样

CR出现目的条带，单酶切成功，双酶切不成功。后来仔细琢磨才发现是连接成功率太低的问题，PCR ...

感谢您的回答问题是我现在测序出来了序列是正确的 Hind III酶切位点突变了但是为什么用Hind III单酶切时还是可以切开啊

26楼2010-04-05 15:22:33

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DNAhelix

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小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
scelab(金币+3):欢迎常来交流~~~:tiger06: 2010-04-06 16:10

引用回帖:

Originally posted by huangdi07 at 2010-04-05 15:22:33:

感谢您的回答问题是我现在测序出来了序列是正确的 Hind III酶切位点突变了但是为什么用Hind III单酶切时还是可以切开啊

测序的开头部分有时不准确的。
既然测序证明目的序列在，两个酶切位点在，也许是甲基化情况影响了另一个酶切位点的酶切。

楼主不妨选择另外的双酶切位点，比如在目的基因内部或在外部。

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智慧活法：不生气，不计较！

27楼2010-04-05 15:36:46

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huangdi07

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好的谢谢你的指导

28楼2010-04-06 08:23:51

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mql1986

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scelab(金币+1):欢迎常来交流~~~:tiger06: 2010-04-06 16:10

四楼言之有理，我做过一个150bp 的亚克隆，情况与楼主的相同，但是我默认正确，就直接诱导表达了，照样能出蛋白。建议测序或者直接默认正确

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29楼2010-04-06 14:13:39

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漫迹

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scelab(金币+1):欢迎常来交流~~~:tiger06: 2010-04-06 16:10

你做pcr是做一下阴性对照，以没连目的片段的载体作为模板，看看能P出目的大小不，有时候可能是酶切体系将DNA稀释了，电泳后小片段会比大片段暗好多，下次酶切电泳后仔细观察下，祝福楼主哦

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30楼2010-04-06 14:17:33

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