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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】关于酶切
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huangdi07

铁杆木虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】关于酶切 已有5人参与

最近做酶切连接时 用pcr验证时有目的条带 分别作单酶切时条带大小也表明连接成功 但是双酶切结果和单酶切一样 没有我连接上的小片段 后来我先用一种酶切 然后回收产物后 再用另一种酶切 可是还是没有切下连接上的小片段 我现在也不知道是否连接上了 请各位大侠帮帮忙
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1楼 2010-03-15 19:03:57
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huangdi07

铁杆木虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by hui_student at 2010-03-30 15:40:46:
哎，辛苦楼主了，想的检测方法不少，你的问题和我以前遇到的一样。或许你找问题的地方不对··
当时我的情况是这样CR出现目的条带，单酶切成功，双酶切不成功。后来仔细琢磨才发现是连接成功率太低的问题，PCR ...

感谢您的回答 问题是我现在测序出来了 序列是正确的 Hind III酶切位点突变了 但是为什么用Hind III单酶切时 还是可以切开啊
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26楼2010-04-05 15:22:33
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jack6335

铁杆木虫 (正式写手)
★
amisking(金币+1): 2010-04-06 08:40
你酶切之前最好测一下序验证，另外，双酶切时buffer一定要选对，使两种酶都保持高的的活性！
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砖石王老三！！！
2楼2010-03-15 20:49:42
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huangdi07

铁杆木虫 (小有名气)
我选用的是fermentas的共用酶切体系啊 可是怎么也切不开啊
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3楼2010-03-15 20:50:58
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷
huangdi07(金币+1): 2010-03-15 21:25
小片段多大，载体多大？如果二者大小差别很大的话，切下的目的片段会很弱，基本很难看见。另外PCR验证的时候，一定要做一个阴性对照（以清水为模板）。
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Thank-you，so-blue.
4楼2010-03-15 21:00:51
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