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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】关于酶切
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huangdi07

铁杆木虫 (小有名气)
怎么都是测序啊 大家没出现过类似问题么
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11楼2010-03-19 09:00:21
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huangdi07

铁杆木虫 (小有名气)
我最近进行测序了 发现Hind III 酶切位点发生了突变 但是用Hind III做单酶切时为什么能切开呢
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12楼2010-03-30 14:32:14
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j2

木虫 (正式写手)
★
huangdi07(金币+1):谢谢参与
如果2段差别很大，一般的电泳看不出来也正常吧
如果只是点突变的话，酶切位点还是可能识别的~
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修炼ｉｎｇ，当虫仙……
13楼2010-03-30 15:12:25
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hui_student

银虫 (小有名气)
★
huangdi07(金币+1):谢谢参与
huangdi07(金币+2): 2010-04-05 15:17
哎，辛苦楼主了，想的检测方法不少，你的问题和我以前遇到的一样。或许你找问题的地方不对··
当时我的情况是这样CR出现目的条带，单酶切成功，双酶切不成功。后来仔细琢磨才发现是连接成功率太低的问题，PCR出条带，是因为存在少量的阳性重组子，单酶切"成功”是因为载体碱基数和我的目的带相比要大的多，加上跑胶与MARKER比较确定的碱基数也很难确定，就自认为是正确··，双酶切可想而知是不成功了，应为阳性重组子太少了。
要是楼主实在找不到答案，我建议你还是重新连接吧··，一定要确定连接体系没问题，确保连接效率，后边的问题就相应的少很多了，祝好运！
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一路前行！
14楼2010-03-30 15:40:46
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yet

铜虫 (小有名气)
★
huangdi07(金币+1):谢谢参与
引用回帖:
Originally posted by huangdi07 at 2010-03-30 14:32:14:
我最近进行测序了 发现Hind III 酶切位点发生了突变 但是用Hind III做单酶切时为什么能切开呢

不要问那么多为什么，能做出来就行。
如果HindIII能切开的话，说明你另一个酶没有切开，建议加大酶量再切！
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15楼2010-03-30 20:31:48
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yinsongna

金虫 (正式写手)
★
huangdi07(金币+1):谢谢参与
我也遇到同样的问题。。。
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16楼2010-03-30 21:54:28
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angel2536

金虫 (著名写手)
★
huangdi07(金币+1):谢谢参与
验证使从质粒上进行PCR吧，理应是连接上了。
不知单酶切是否完全切开，是不是酶活性不行了？
按你说的，第二种方案已经可行了，单还是没切出就不应该了。。。。
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17楼2010-03-31 10:12:42
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王庭

木虫 (著名写手)
★
huangdi07(金币+1):谢谢参与
会不会是两种酶所需活性条件差别大啊，这样就导致只有单酶起明显的作用
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努力做最好的自己！！
18楼2010-03-31 10:34:31
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十二1130

银虫 (小有名气)
★
huangdi07(金币+1):谢谢参与
我也遇到了同样的问题，双酶切之后目的条带根本就看不到
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19楼2010-03-31 14:25:29
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acaifeng

银虫 (初入文坛)
★
huangdi07(金币+1):谢谢参与
测序来的比较直接
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20楼2010-03-31 14:38:35
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