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huangdi07

铁杆木虫 (小有名气)

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[交流] 【求助/交流】关于酶切已有5人参与

最近做酶切连接时用pcr验证时有目的条带分别作单酶切时条带大小也表明连接成功但是双酶切结果和单酶切一样没有我连接上的小片段后来我先用一种酶切然后回收产物后再用另一种酶切可是还是没有切下连接上的小片段我现在也不知道是否连接上了请各位大侠帮帮忙

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1楼 2010-03-15 19:03:57

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hui_student

银虫 (小有名气)

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★
huangdi07(金币+1):谢谢参与
huangdi07(金币+2): 2010-04-05 15:17

哎，辛苦楼主了，想的检测方法不少，你的问题和我以前遇到的一样。或许你找问题的地方不对··
当时我的情况是这样

CR出现目的条带，单酶切成功，双酶切不成功。后来仔细琢磨才发现是连接成功率太低的问题，PCR出条带，是因为存在少量的阳性重组子，单酶切"成功”是因为载体碱基数和我的目的带相比要大的多，加上跑胶与MARKER比较确定的碱基数也很难确定，就自认为是正确··，双酶切可想而知是不成功了，应为阳性重组子太少了。
要是楼主实在找不到答案，我建议你还是重新连接吧··，一定要确定连接体系没问题，确保连接效率，后边的问题就相应的少很多了，祝好运！