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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】手提质粒
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芥末蚕豆

铜虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】手提质粒

碱裂解法提取质粒原理说：染色体DNA和质粒DNA在PH值高达12.6的碱性条件下而变性，当以PH值4.8的NaAC高盐缓冲液调节其PH值至中性时，变性的质粒DNA又复性。我想问一下，所说的调节PH值至中性，是对的吗？我加100ul溶液1、200ul溶液2、150ul溶液3后，溶液的PH值大概是4.8，属酸性范围，我想问一下，是我配错试剂了，还是就是这样，还是还要加碱调节？
我现在提出来的质粒少，会不会是上面这个因素影响的？
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1楼 2010-03-08 21:29:13
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mever

木虫 (正式写手)
★
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调节值中性是正确的
但你质粒量少应该不是PH值的问题
应该是第二步裂解细菌不充分造成的
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2楼2010-03-08 21:50:31
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen
★
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手提质粒 试剂应该是提前配好的吧，直接用的
不过现在都用试剂盒，效率蛮高的~
你可以尝试着把菌刮多一点~
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Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
3楼2010-03-08 21:53:33
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芥末蚕豆

铜虫 (初入文坛)
菌量肯定不少！隔壁的师姐用了我得一半，提出来的超亮！人家不让参观，我也不知道问题出在哪里了！
大家都是按照工具书的操作的！今天测了一下，加完溶液3之后，上请PH是4.8！不是中性！是不是问题出在这了啊？
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4楼2010-03-09 12:30:54
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
★
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第二步是裂解细胞，如果第一步细胞悬浮均匀，第二步质量好的话就会整个管子里都是澄清的。第三步是使质粒DNA复性，加入溶液三之后细胞裂解释放出的蛋白质和其它较大分子化合物会纠缠在一起，在接下来的离心中被离下去，而质粒则溶解在溶液中。溶液三可以用铵离子，也可以用钾离子，不止是钠离子可以用的，楼主可以一试。再说了，抽提会使质粒的量损失，别人抽提次数少可能损失就少。最后质粒洗完干燥后重新溶解用的溶液多，质粒总量一定的，自然加得越多浓度就越稀了。

为什么隔壁的人会帮助提取，但是不让参观学习？怪！
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流星来时我许了个愿，愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具，久不看论坛一来就提问者，宁弃EPI和VIP也不回帖。
5楼2010-03-09 13:21:37
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芥末蚕豆

铜虫 (初入文坛)
隔壁是生物芯片公司，和学校那么一点点联合的意思，但有关实验的东西，都不让说！但是呢，正好她们公司的一个职员和我同学住在一起，请教了一下，她说可以帮着提提，看看是不是本来质粒就少！结果人家提的就很亮！
但是，我还是想知道，加完溶液3，离心，此时的上清到底PH值是多少，是中性还是酸性啊？（是不是我有点魔障了！）
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6楼2010-03-09 16:11:55
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
★
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别问了，三种溶液三都配好，分别用，看看各自效果怎样，反正也就是一个上午的事情。

至少应该能够告诉你用了多少多少菌体提取，抽提多少次，最后用多少溶液来溶解，这都不属于商业机密。
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7楼2010-03-09 16:44:09
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