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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】GST融合蛋白包涵体纯化及做抗体的问题
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lzh860801

金虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】GST融合蛋白包涵体纯化及做抗体的问题

我现在有一个10KD大小的蛋白需要做抗体
连到PGEX载体上表达出来的GST融合蛋白是包涵体
有人说GST融合蛋白如果用尿素变性后就挂不上柱子了
那么我这个融合蛋白应该如何纯化呢？
变性后的蛋白可以直接拿去做抗体，但是我的目的蛋白质有10KD GST标签是26KD
我这样的情况是不是需要先将GST酶切掉？
看分子克隆上的关于GST融合蛋白的酶切是先将融合蛋白挂柱 然后酶切。
这样来的话问题是我的融合蛋白是包涵体，如果变性了就挂不上柱子了。。。
希望各位老师指导下！
（另外我也做了his的融合蛋白。。。不知道是不是N端有信号肽的缘故，做了好几次都挂不上柱）
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1楼 2010-03-05 19:13:16
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wh19850902

至尊木虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
虽然我对包涵体做抗体的目的不是很清楚，但我工作是关于单克隆抗体的，我们一般对于小分子的蛋白（小于10kd）需加标签后做抗原免疫，同时我们也会针对标签蛋白做筛选，得到针对小分子蛋白的抗体，我不知道我讲的对你是否有帮助
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2楼2010-03-07 13:44:28
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msw0103

金虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
GST载体的一般包涵体很少，GST包涵体你可以用8M尿素/6M盐酸胍变性，然后再逐级降低变性剂浓度，透析复性，给它营造一个缓慢折叠的过程，透析液加少量甘油，一般5%，在透析过程中蛋白样品加一点PMSF保证蛋白不被降解，有时加一点乳化剂（TritonX100,NP40等等），一般不超过1%。 复性之后再纯化啊，应该可以挂柱吧，可以柱上酶切，也可以纯化后酶切，在做抗体。
不知道说的对不对
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3楼2010-03-07 20:53:01
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plantst5928

铜虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
分子克隆上有关于表达GST不溶性蛋白的处理方法，我就是按照这个方法将包涵体破碎的。纯化的很好。
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4楼2010-03-07 21:16:30
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