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elliott2591

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】5'RACE 已有3人参与

最近在做5‘RACE,用的是Takara的盒子,innerPCR之后条带在1.5k~3k之间弥散,提高退火温度至65°,降低Mg浓度及dNTPs用量,稀释outer 产物50倍,取4ul,等等方法均尝试仍如此,实在无法解决,求助各位大侠!
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695

木虫 (职业作家)

elliott2591(金币+1):我的酶没有问题,因为我做3RACE也用的该酶 2010-03-18 20:13
elliott2591(金币+1): 2010-03-18 20:14
我当时用的是clonetech的盒子,很顺利的,你的酶应该好用吧?其他的因素一般不会出什么问题的
2楼2010-03-04 00:52:07
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elliott2591

金虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by 695 at 2010-03-04 00:52:07:
我当时用的是clonetech的盒子,很顺利的,你的酶应该好用吧?其他的因素一般不会出什么问题的

我用的酶是LA Taq(Takara的),换了KOD依然如此,不知道是什么原因了
3楼2010-03-04 10:20:05
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yujiaping1

木虫 (著名写手)

elliott2591(金币+1):也有可能,不过我换了引物还是不行,哎,郁闷啊 2010-03-18 20:14
可能跟引物有关系,建议你重新设计引物,一般5RACE得设计两三条引物才有可能有好的,想一个就出好,除非运气很好

[ Last edited by yujiaping1 on 2010-3-4 at 13:01 ]
4楼2010-03-04 10:59:54
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jasco

木虫 (正式写手)

引用回帖:
Originally posted by yujiaping1 at 2010-03-04 10:59:54:
可能跟引物有关系,建议你重新设计引物,一般5RACE得设计两三对引物才有可能有好的,想一个就出好,除非运气很好

同意,race有时候真的说不准
5楼2010-03-04 12:56:08
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yujiaping1

木虫 (著名写手)

你试试巢式PCR吧,设计两个引物,先跑外面的引物,然后用PCR产物做模板,再跑里面的引物,这个用clontech的盒子是有介绍的,宝生物的盒子就不了解了,不过跑个半巢式PCR应该是没有问题的,就是Universal引物一直使用
6楼2010-03-18 21:35:41
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cqyniu

金虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by 695 at 2010-03-04 00:52:07:
我当时用的是clonetech的盒子,很顺利的,你的酶应该好用吧?其他的因素一般不会出什么问题的

请问你用的clonetech的盒子做5'RACE时,PCR反应条件也是严格按照那个盒子的说明做的吗?我已经做了半年了,可是还是毫无进展,希望可以和你交流交流!
7楼2010-04-15 15:47:59
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genewind

金虫 (小有名气)

本人没用试剂盒,反转录后加个polyA尾巴。
8楼2010-04-15 15:50:03
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genewind

金虫 (小有名气)

可以给你那本PCR的书籍!QQ250748548
9楼2010-04-15 15:50:37
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liyong1981

金虫 (正式写手)


elliott2591(金币+1):谢谢,在改进方法┄┄ 2010-04-22 16:59
做5RACE本来即使要看运气,你可以多试试在引物上下功夫,实在没有结果,你可以做WALKING,看能往上游走多少,软件分析下,到没到你的期望,5端的帽子很容易降解,你提RNA的时候要尽可能保证RNA的质量,和反转录的效率
10楼2010-04-15 16:13:43
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