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nankou2008

铁杆木虫 (著名写手)

肥南瓜

[交流] 【求助/交流】实时荧光定量PCR标准曲线扩增效率问题

做实时荧光定量PCR,目的基因和内参基因的标准曲线R2都可以达到0.98以上,但是扩增效率都比较低,不知会是什么原因导致的,有没有什么办法改进?
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湖深而静溪浅而鸣
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yujiaping1

木虫 (著名写手)

nankou2008(金币+1):谢谢 2010-01-29 11:26
R方0.98也不算高啊,我们做一般都要0.99以上才好,不过你这个也能凑合用
标准曲线绘制时不要混合太厉害,要现配现用,一般注意这两点,效率可以到0.96以上
2楼2010-01-29 10:52:52
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地图蜗牛

银虫 (小有名气)

nankou2008(金币+1):谢谢,提高引物浓度可以提高扩增效率吗? 2010-01-29 11:27
很多原因,尝试优化引物浓度(引物设计也很重要的);不同公司的试剂也有差异;退火温度也可以调整
3楼2010-01-29 11:00:33
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nankou2008

铁杆木虫 (著名写手)

肥南瓜

引用回帖:
Originally posted by yujiaping1 at 2010-01-29 10:52:52:
R方0.98也不算高啊,我们做一般都要0.99以上才好,不过你这个也能凑合用
标准曲线绘制时不要混合太厉害,要现配现用,一般注意这两点,效率可以到0.96以上

我们做的R2可以达到0.99的,只是计算机软件默认的是要大于0.98。“标准曲线绘制时不要混合的太厉害”这句没有理解,能否详细说明下,多谢了!
湖深而静溪浅而鸣
4楼2010-01-29 11:25:55
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yujiaping1

木虫 (著名写手)

nankou2008(金币+1):谢谢 2010-02-01 18:19
引用回帖:
Originally posted by nankou2008 at 2010-01-29 11:25:55:


我们做的R2可以达到0.99的,只是计算机软件默认的是要大于0.98。“标准曲线绘制时不要混合的太厉害”这句没有理解,能否详细说明下,多谢了!

就是不能涡旋太久,也不要总用枪来回抽吸,一般轻轻涡旋几下,轻柔短时,三次,就可以了,确定混匀即可,不要长时间剧烈混合
5楼2010-01-29 12:46:02
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