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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】实时荧光定量PCR标准曲线扩增效率问题
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nankou2008

铁杆木虫 (著名写手)

肥南瓜

[交流] 【求助/交流】实时荧光定量PCR标准曲线扩增效率问题

做实时荧光定量PCR，目的基因和内参基因的标准曲线R2都可以达到0.98以上，但是扩增效率都比较低，不知会是什么原因导致的，有没有什么办法改进？
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湖深而静溪浅而鸣
1楼 2010-01-29 09:28:46
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yujiaping1

木虫 (著名写手)
nankou2008(金币+1):谢谢 2010-01-29 11:26
R方0.98也不算高啊，我们做一般都要0.99以上才好，不过你这个也能凑合用
标准曲线绘制时不要混合太厉害，要现配现用，一般注意这两点，效率可以到0.96以上
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2楼2010-01-29 10:52:52
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地图蜗牛

银虫 (小有名气)
nankou2008(金币+1):谢谢，提高引物浓度可以提高扩增效率吗？ 2010-01-29 11:27
很多原因，尝试优化引物浓度（引物设计也很重要的）；不同公司的试剂也有差异；退火温度也可以调整
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3楼2010-01-29 11:00:33
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nankou2008

铁杆木虫 (著名写手)

肥南瓜
引用回帖:
Originally posted by yujiaping1 at 2010-01-29 10:52:52:
R方0.98也不算高啊，我们做一般都要0.99以上才好，不过你这个也能凑合用
标准曲线绘制时不要混合太厉害，要现配现用，一般注意这两点，效率可以到0.96以上

我们做的R2可以达到0.99的，只是计算机软件默认的是要大于0.98。“标准曲线绘制时不要混合的太厉害”这句没有理解，能否详细说明下，多谢了！
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湖深而静溪浅而鸣
4楼2010-01-29 11:25:55
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yujiaping1

木虫 (著名写手)
nankou2008(金币+1):谢谢 2010-02-01 18:19
引用回帖:
Originally posted by nankou2008 at 2010-01-29 11:25:55:


我们做的R2可以达到0.99的，只是计算机软件默认的是要大于0.98。“标准曲线绘制时不要混合的太厉害”这句没有理解，能否详细说明下，多谢了！

就是不能涡旋太久，也不要总用枪来回抽吸，一般轻轻涡旋几下，轻柔短时，三次，就可以了，确定混匀即可，不要长时间剧烈混合
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5楼2010-01-29 12:46:02
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