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yangym1123

木虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】克隆出现的奇怪问题,请教各位大虾!

最近有个同学做克隆时出现下面的问题:用LATaq酶进行PCR扩增得到一条2.0K左右的条带,连接进入pMD18-TVector,挑取单克隆进行菌落PCR验证(普通Taq酶),验证只有100多bp左右的条带,用LATaq酶进行验证得到目的条带和一条100 多bp条带,提取质粒后酶切也得到了目的条带2.0K左右的带(看到目的条带和载体带),送菌液测序,测序结果非常奇怪,测出来是100多bp的条带,为什么酶切验证过有目的条带2.0的片段,测序却测出来是100多bp呢?请教各位大虾,谢谢啦!
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grxx_wj


yangym1123(金币+1):谢谢参与
你没跟测序的说你要2K的吗 人家以为 你要100的呢 凡是连上去的 都能测 放心吧
2楼2010-01-27 09:32:50
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hhwang

木虫 (小有名气)


yangym1123(金币+1):谢谢参与
测反了吧
3楼2010-01-27 13:07:44
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yangym1123

木虫 (小有名气)

没有测反,测序要求也是说是2.0K的,但是测序结果就是100bp左右!
4楼2010-01-27 13:35:04
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biogefart

木虫 (著名写手)


yangym1123(金币+1):谢谢参与
基因是不是有特殊结构?
闹太套
5楼2010-01-27 13:36:46
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yujiaping1

木虫 (著名写手)


yangym1123(金币+1):谢谢参与
测序公司肯定是用普通酶做的反应,所以你给他们提供点酶,重新测
6楼2010-01-27 13:59:50
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zjwang

木虫 (正式写手)


yangym1123(金币+1):谢谢参与
100BP是目的基因序列吗?正反向测呢?
7楼2010-01-28 15:07:20
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yangym1123(金币+1):谢谢参与
顶一下!
8楼2010-01-29 18:00:57
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mayerpaco

铁虫 (小有名气)


yangym1123(金币+1):谢谢参与
还真是怪异呢……
9楼2010-02-02 16:02:49
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夜舞龙

至尊木虫 (知名作家)


yangym1123(金币+1):谢谢参与
yangym1123(金币+1):谢谢! 2010-02-04 09:21
酶切是用引物上带的酶切位点吗?
因为pMD18大概也是2KB多,如果酶切不完全,环状的质粒和切开的线状质粒也会明显分为两条带,切成线状的pMD18也会出现在2KB多的位置上。这可能说连进去的不是目的片段,只是100多的片段。
但是LATaq酶进行验证却能得到目的条带,这就不好说了,和上边的结论又矛盾了。
又或者是单克隆没挑好?有杂菌存在。既有连进去目的片段的菌落,又有连上100BP杂带的菌落?
10楼2010-02-02 16:52:46
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