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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】克隆出现的奇怪问题，请教各位大虾！
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yangym1123

木虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】克隆出现的奇怪问题，请教各位大虾！

最近有个同学做克隆时出现下面的问题：用LATaq酶进行PCR扩增得到一条2.0K左右的条带，连接进入pMD18-TVector，挑取单克隆进行菌落PCR验证（普通Taq酶），验证只有100多bp左右的条带，用LATaq酶进行验证得到目的条带和一条100 多bp条带，提取质粒后酶切也得到了目的条带2.0K左右的带（看到目的条带和载体带），送菌液测序，测序结果非常奇怪，测出来是100多bp的条带，为什么酶切验证过有目的条带2.0的片段，测序却测出来是100多bp呢？请教各位大虾，谢谢啦！
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1楼 2010-01-27 09:03:00
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grxx_wj

★
yangym1123(金币+1):谢谢参与
你没跟测序的说你要2K的吗 人家以为 你要100的呢 凡是连上去的 都能测 放心吧
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2楼2010-01-27 09:32:50
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hhwang

木虫 (小有名气)
★
yangym1123(金币+1):谢谢参与
测反了吧
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3楼2010-01-27 13:07:44
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yangym1123

木虫 (小有名气)
没有测反，测序要求也是说是2.0K的，但是测序结果就是100bp左右！
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4楼2010-01-27 13:35:04
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biogefart

木虫 (著名写手)
★
yangym1123(金币+1):谢谢参与
基因是不是有特殊结构？
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闹太套
5楼2010-01-27 13:36:46
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yujiaping1

木虫 (著名写手)
★
yangym1123(金币+1):谢谢参与
测序公司肯定是用普通酶做的反应，所以你给他们提供点酶，重新测
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6楼2010-01-27 13:59:50
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zjwang

木虫 (正式写手)
★
yangym1123(金币+1):谢谢参与
100BP是目的基因序列吗？正反向测呢？
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7楼2010-01-28 15:07:20
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yinzhiminghao
★
yangym1123(金币+1):谢谢参与
顶一下！
8楼2010-01-29 18:00:57
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mayerpaco

铁虫 (小有名气)
★
yangym1123(金币+1):谢谢参与
还真是怪异呢……
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9楼2010-02-02 16:02:49
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夜舞龙

至尊木虫 (知名作家)
★
yangym1123(金币+1):谢谢参与
yangym1123(金币+1):谢谢！ 2010-02-04 09:21
酶切是用引物上带的酶切位点吗？
因为pMD18大概也是2KB多，如果酶切不完全，环状的质粒和切开的线状质粒也会明显分为两条带，切成线状的pMD18也会出现在2KB多的位置上。这可能说连进去的不是目的片段，只是100多的片段。
但是LATaq酶进行验证却能得到目的条带，这就不好说了，和上边的结论又矛盾了。
又或者是单克隆没挑好？有杂菌存在。既有连进去目的片段的菌落，又有连上100BP杂带的菌落？
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10楼2010-02-02 16:52:46
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