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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】弱问一下农杆菌转化操作的一些细节问题
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jcjcj

铜虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】弱问一下农杆菌转化操作的一些细节问题

新手，实验室也没有人做过，所以上来请教
请问dmso配利福平的时候需要过滤除菌吗
加了利福平抗性的平板或者试管是要避光的吗？避光的要求严格吗？
我的gv3101感受态是利福平和卡那抗性的，想转化的质粒也是卡那抗性的，这样转化合适吗？阳性克隆的确定是不是只能用pcr检测？但是我担心即使有阳性克隆，在传代的过程中转化的质粒会不会丢失呢？加两倍的卡那能解决问题吗？
谢谢了
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1楼 2010-01-22 21:57:17
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pengl001

木虫 (小有名气)
★ ★
jcjcj(金币+1):谢谢参与
1949stone(金币+1): 1-23 12:30
its better to use filter before you add 利福平
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Yes,Ican!
2楼2010-01-23 04:26:03
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biogefart

木虫 (著名写手)
★ ★
jcjcj(金币+1):谢谢参与
1949stone(金币+1): 1-23 12:31
楼上说的有理，最好滤一下抗生素，另外菌株和质粒都是kan抗性的话，质粒的抗性筛选功能就失去了，到时候长的满满板的估计得挑一个月克隆做PCR鉴定。
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闹太套
3楼2010-01-23 08:21:06
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gaozx123

金虫 (小有名气)
★ ★ ★
jcjcj(金币+1):谢谢参与
1949stone(金币+2): 1-23 12:31
我们实验室有人做，刚咨询了一下，他们一直用75%乙醇配利福平，不过滤除菌。配75乙醇的超纯水灭菌，在超净台配制。没有问题。
卡纳也用超纯水配制，也没有过滤。同样是在超净台中配。
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4楼2010-01-23 10:10:51
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fungixx

至尊木虫 (文坛精英)

优秀版主优秀版主优秀版主
★
jcjcj(金币+1):谢谢参与
DMSO配制利福平不用过滤；
没在意需不需要避光，应该不用吧；
GV3101的抗性是硫酸庆大跟利福平吧，没有kan抗性吧！,我也用这株菌；
阳性克隆可以用菌液pcr，提质粒酶切也行
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几年前踏上火车那一刻都还没有意识到,从此故乡只有冬夏,再无春秋
5楼2010-01-23 12:53:56
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jcjcj

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by fungixx at 2010-1-23 12:53:
DMSO配制利福平不用过滤；
没在意需不需要避光，应该不用吧；
GV3101的抗性是硫酸庆大跟利福平吧，没有kan抗性吧！,我也用这株菌；
阳性克隆可以用菌液pcr，提质粒酶切也行

可是我拿到的菌株对方说是卡那和利福平抗的啊
gv3101也有不同的菌株吗
不需要避光吗？利福平不是光敏感的吗？

[ Last edited by jcjcj on 2010-1-23 at 13:25 ]
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6楼2010-01-23 13:18:39
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jcjcj

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by biogefart at 2010-1-23 08:21:
楼上说的有理，最好滤一下抗生素，另外菌株和质粒都是kan抗性的话，质粒的抗性筛选功能就失去了，到时候长的满满板的估计得挑一个月克隆做PCR鉴定。

其实我更担心的是即使挑到了也会因为没有抗性的压力丢失质粒
有没有什么好的办法呢？质粒不是自己构建的，而且也没有条件改变
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7楼2010-01-23 13:21:13
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fungixx

至尊木虫 (文坛精英)

优秀版主优秀版主优秀版主
★ ★
jcjcj(金币+2):谢谢啊 1-23 23:22
引用回帖:
Originally posted by jcjcj at 2010-1-23 13:18:


可是我拿到的菌株对方说是卡那和利福平抗的啊
gv3101也有不同的菌株吗
不需要避光吗？利福平不是光敏感的吗？

[ Last edited by jcjcj on 2010-1-23 at 13:25 ]

不会的，除非他给你是转化了的：Strain GV3101: resistant to gentamycin and rifampicin so add 25-50 ug/ml Gentamycin, 10 ug/ ml rifampicin on plates or in liquid media for selection. GV3101 is sensitive to kanamycin (or chloramphenicol), so is a good strain for use with binary vectors that confer kan resistance (or chloramphenicol resistance) in bacteria (e.g. transformed cells will be Gent, rif and Kan resistant). GV3101 carries a disarmed Ti plasmid that possesses the vir genes needed for T-DNA transfer, but has no functional T-DNA region of its own.
我没太在意利福平是否需要避光，不过也没有出现什么问题，可能应该吧，毕竟包装瓶都是棕色的
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几年前踏上火车那一刻都还没有意识到,从此故乡只有冬夏,再无春秋
8楼2010-01-23 13:35:09
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jcjcj

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by fungixx at 2010-1-23 13:35:


不会的，除非他给你是转化了的：Strain GV3101: resistant to gentamycin and rifampicin so add 25-50 ug/ml Gentamycin, 10 ug/ ml rifampicin on plates or in liquid media for selection. GV3101 is sen ...

那如果不加庆大霉素会有什么影响啊？
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9楼2010-01-23 23:28:13
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gn2003_0

金虫 (小有名气)
★
jcjcj(金币+1):谢谢参与
利福平可以不用过滤，但是配制时要严格无菌。你的菌是卡纳抗性，转化质粒也是卡纳抗性，有点不合适吧？最后你不知道转化菌的卡纳抗性是本身的还是转化得到的。
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10楼2010-01-24 09:11:27
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