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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】求助荧光定量PCR实验问题
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taoran2099

新虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】求助荧光定量PCR实验问题

我在做荧光定量PCR实验（样品中DNA的绝对定量，SYBR Green染料法）时，遇到了一个问题：有一个基因无法定量，无论是自己构建的标准质粒还是样品，经过10倍梯度稀释后，做荧光定量时，所有的样品Ct值都集中在15附近，无法得到标准曲线。理想情况下，样品的浓度减小，Ct值应该会增大；浓度每减小10倍，Ct值应增大3.2左右。我换用反应试剂，重新配置引物后还是如此。
       后来发现我做荧光定量PCR的7个基因中（扩增产物均在250bp以下），只有这个基因选用的引物其中一条引物中有2个兼并碱基（其他6个基因的引物没有兼并碱基，都可以很好的扩增和定量）。我想问题是不是出在这里？做荧光定量PCR的引物是不是严格要求不能有兼并碱基？或是其他的原因导致无法定量？
       请高手为小弟答疑解惑，感激不尽！
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1楼 2010-01-16 14:05:25
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ljwei_163

金虫 (正式写手)
★ ★
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1949stone(金币+1,VIP+0): 1-16 18:03
用兼并引物会不会产生非特异性扩增啊？难道是这个原因造成的？
期待高手
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3楼2010-01-16 16:13:55
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沙中清泉

木虫 (正式写手)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
1949stone(金币+1,VIP+0): 1-16 18:03
这个情况是很奇怪哦，没遇到过，兼并碱基是什么意思
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2楼2010-01-16 14:47:55
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taoran2099

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by 沙中清泉 at 2010-1-16 14:47:
这个情况是很奇怪哦，没遇到过，兼并碱基是什么意思

引物中某个位置上有兼并碱基，是指在那个位置上碱基不唯一，可以有变化。
例如：AGTCGACAGYRGCGCCGGC，该引物序列中有2个兼并碱基YR，Y代表C 或T，R代表A或G。
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4楼2010-01-16 21:07:04
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yujiaping1

木虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
建议用普通点用检测一下PCR产物，看条带是否单一，我怀疑是有非特异性扩增
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5楼2010-01-16 21:47:40
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