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【求助/交流】求助荧光定量PCR实验问题
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我在做荧光定量PCR实验（样品中DNA的绝对定量，SYBR Green染料法）时，遇到了一个问题：有一个基因无法定量，无论是自己构建的标准质粒还是样品，经过10倍梯度稀释后，做荧光定量时，所有的样品Ct值都集中在15附近，无法得到标准曲线。理想情况下，样品的浓度减小，Ct值应该会增大；浓度每减小10倍，Ct值应增大3.2左右。我换用反应试剂，重新配置引物后还是如此。 后来发现我做荧光定量PCR的7个基因中（扩增产物均在250bp以下），只有这个基因选用的引物其中一条引物中有2个兼并碱基（其他6个基因的引物没有兼并碱基，都可以很好的扩增和定量）。我想问题是不是出在这里？做荧光定量PCR的引物是不是严格要求不能有兼并碱基？或是其他的原因导致无法定量？ 请高手为小弟答疑解惑，感激不尽！ |
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