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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】膜蛋白（膜酶）的分离纯化
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liaozi

[交流] 【求助/交流】膜蛋白（膜酶）的分离纯化

最近在做链霉菌细胞膜关联酶的提取，发现酶活一直好低啊，郁闷，过了DEAE后所有的峰的没货性了。

我提粗酶的步骤是：菌体1：3悬浮，400W破10min，12000r/min冷冻离心30min,去上清，沉淀用含1%TritonX-100的缓冲液悬浮，搅匀后静置1h，然后12000r/min冷冻离心30min，取上清液为粗酶液，测酶活（很低)

想请教各位有知道有提取膜酶的好方法吗？或者是实例？
用1%TritonX-100溶解膜酶是不是容易使酶失活啊？

万分感谢！
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1楼 2010-01-13 17:11:04
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wwyy0818

新虫 (小有名气)
★ ★
1949stone(金币+2,VIP+0): 1-13 23:04
你的膜蛋白要是跨膜结构只有1-4个话,你可以试试PIERCE的膜蛋白提取试剂盒，如果大于4个，则超高速离心。。。
膜蛋白提取很困难，自己多摸索摸索
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2楼2010-01-13 17:53:50
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hhwang

木虫 (小有名气)
★ ★ ★
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1949stone(金币+2,VIP+0): 1-13 23:04
把细胞膜破碎同时保酶活很重要，但是挺难的
而且破碎的细胞膜常常会自组装，把酶重新包裹，所以这又是个问题。
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3楼2010-01-13 18:54:39
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guoenwen

金虫 (小有名气)
膜蛋白是很难做的，建议用温和的方法破碎细胞，还有不要用TritonX-100，这个东西会和膜蛋白作用的，使很多膜蛋白溶解掉，估计不利于与膜蛋白关联酶的提取，
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4楼2010-01-14 20:44:31
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t85434577563

铁虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
超声破碎对于霉菌之类的微生物效果很差，可以改成液氮研磨，以前我们实验室也做过根霉的膜蛋白纯化就是用的这种方法，另外表面活性剂的使用，最好做个优化，譬如种类和浓度，最后溶解膜蛋白的时候，最好低温下缓慢搅拌，不要静置，这样效果要好
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5楼2010-01-15 08:41:14
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成功进步！

金虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
1%TritonX-100的PH为8.0~8.5，而你的酶在这个环境下有无影响啊，最好做一下检测，因为酶受PH影响是很大的
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6楼2010-01-17 13:16:47
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成功进步！

金虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
还有就是，菌体混悬液再稀点，1：10或15（看黏稠程度），离心最好分布进行，4500rpm到7500rpm最后在用12000rpm。菌体溶解多糖、蛋白及外膜蛋白一般都必须分步进行的。
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7楼2010-01-17 13:26:44
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liaozi

谢谢楼上各位的建议
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8楼2010-01-17 15:33:25
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liaozi

引用回帖:
Originally posted by guoenwen at 2010-1-14 20:44:
膜蛋白是很难做的，建议用温和的方法破碎细胞，还有不要用TritonX-100，这个东西会和膜蛋白作用的，使很多膜蛋白溶解掉，估计不利于与膜蛋白关联酶的提取，

那什么方法破碎比较温和且效果较好呢？

我看资料一般都是用TritonX-100来溶解（抽提）膜蛋白的，还有什么更好的方法能将膜蛋白从细胞膜上溶解下来呢？

期待指教，谢谢(*^__^*)
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9楼2010-01-17 15:38:36
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liaozi

引用回帖:
Originally posted by hhwang at 2010-1-13 18:54:
把细胞膜破碎同时保酶活很重要，但是挺难的
而且破碎的细胞膜常常会自组装，把酶重新包裹，所以这又是个问题。

破碎细胞同时保持酶活性很重要是毋庸置疑的，那就是要在缓冲液中加蛋白酶抑制剂和酶保护剂了？
我看用的多的蛋白酶抑制剂有PMSF、保护剂有DTT，他们是提所有酶都通用的吗？效果好吗？

期待指教，谢谢(*^__^*)
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10楼2010-01-17 15:52:39
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