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liaozi

[交流] 【求助/交流】膜蛋白(膜酶)的分离纯化

最近在做链霉菌细胞膜关联酶的提取,发现酶活一直好低啊,郁闷,过了DEAE后所有的峰的没货性了

我提粗酶的步骤是:菌体1:3悬浮,400W破10min,12000r/min冷冻离心30min,去上清,沉淀用含1%TritonX-100的缓冲液悬浮,搅匀后静置1h,然后12000r/min冷冻离心30min,取上清液为粗酶液,测酶活(很低)

想请教各位有知道有提取膜酶的好方法吗?或者是实例?
用1%TritonX-100溶解膜酶是不是容易使酶失活啊?

万分感谢!
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hhwang

木虫 (小有名气)

★ ★ ★
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1949stone(金币+2,VIP+0): 1-13 23:04
把细胞膜破碎同时保酶活很重要,但是挺难的
而且破碎的细胞膜常常会自组装,把酶重新包裹,所以这又是个问题。
3楼2010-01-13 18:54:39
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wwyy0818

新虫 (小有名气)

★ ★
1949stone(金币+2,VIP+0): 1-13 23:04
你的膜蛋白要是跨膜结构只有1-4个话,你可以试试PIERCE的膜蛋白提取试剂盒,如果大于4个,则超高速离心。。。
膜蛋白提取很困难,自己多摸索摸索
2楼2010-01-13 17:53:50
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guoenwen

金虫 (小有名气)

膜蛋白是很难做的,建议用温和的方法破碎细胞,还有不要用TritonX-100,这个东西会和膜蛋白作用的,使很多膜蛋白溶解掉,估计不利于与膜蛋白关联酶的提取,
4楼2010-01-14 20:44:31
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t85434577563

铁虫 (小有名气)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
超声破碎对于霉菌之类的微生物效果很差,可以改成液氮研磨,以前我们实验室也做过根霉的膜蛋白纯化就是用的这种方法,另外表面活性剂的使用,最好做个优化,譬如种类和浓度,最后溶解膜蛋白的时候,最好低温下缓慢搅拌,不要静置,这样效果要好
5楼2010-01-15 08:41:14
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