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xiaorong-er

金虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】引物的Tm值到底以哪个为准

我用oligo6设计出的引物Tm值要比引物公司给的值高很多,在CNBI上BLAST得到的信息其Tm值又是不一样,到底以哪个为准比较好,我基本按引物公司给的Tm值做一个梯度实验,但是有时候却什么也得不到,RNA肯定是没有问题的,因为内参的目的片段可以扩增出来的,是不是引物不行,还是温度设计的不对?还请高手指点。谢谢!
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yujiaping1

木虫 (著名写手)


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引用回帖:
Originally posted by xiaorong-er at 2010-1-10 11:17:
RNA肯定是没有问题 ...

梯度退火温度总是能解决这个问题的,都是经验算法,不能说谁准谁不准,针对不同的引物,不同的方法会有效,都是估计值。如果觉得筛选温度费劲,不如touch down了

但是楼主有个问题要注意一下,内参能跑出来,证明RNA没有问题这是对的,但是并不代表这样你就能扩增出来,其中引物是一方面原因,目的基因的丰度又是另一个很重要的因素,有的时候扩增失败,是由于目的基因丰度太低造成的,所以还要注意提取RNA的组织,刺激目的基因表达等,另外直接增加RNA的用量都是有用的
12楼2010-01-13 14:10:22
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yzhang1986

铁杆木虫 (文坛精英)

优秀版主

★ ★
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1949stone(金币+1,VIP+0): 1-10 12:52
梯度都做不出的话,多半引物问题
我们一般自己算tm
2楼2010-01-10 11:43:02
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seahow

木虫 (著名写手)

★ ★
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1949stone(金币+1,VIP+0): 1-10 12:52
应用 软件 评价以下引物。
3楼2010-01-10 12:01:25
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匿名

用户注销 (著名写手)

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司马诸葛(金币+1,VIP+0): 1-10 16:04
本帖仅楼主可见
5楼2010-01-10 15:01:51
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