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【求助/交流】枯草芽孢杆菌的转化
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 蛋白表达纯化鉴定精华 | 枯草芽孢 |
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gxsulong
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这个我用过，效果还不错。 枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备方法 1、菌种在斜面培养2天，孢子形成率接近100%。 2、接于5ml GMⅠ溶液，在30℃慢摇床（100rpm）振荡培养过夜。 3、次日取2ml转接到18ml GMⅠ中，37℃快摇床（200rpm）培养3.5小时。 4、再取10ml转接到90ml GMⅡ中，37℃慢摇床培养90分钟，离心收集菌体。 5、用10ml上清液悬浮菌体，并加30%的灭菌甘油至10%，混匀后分装到离心管中（0.5ml/Tube），随即放到-70℃保存。 6、转化时取出离心管，放在45℃水浴中溶化，然后在0.5ml菌液中加入适量DNA（1ug/ml）。 7、于37℃缓慢振荡（80rpm）保温30分钟后涂抗性平板，再在37℃培养过夜，次日检查转化子。 【培养基配方】 1.10×最低盐溶液：K2HPO4 14g（K2HPO4.3H2O 18.34g），KH2PO4 6g，(NH4)2SO4 2g，柠檬酸钠（Na3C6H5O7.2H2O）1g，MgSO4.7H2O 0.2g，在蒸馏水中依次溶解，加水至100ml。 2.L- trp溶液，2mg/ml，贮于棕色瓶内，113℃灭菌30min，用黑纸包裹。 3.GMⅠ溶液：1×最低盐溶液95ml，50%葡萄糖1ml，5%水解酪蛋白0.4ml，10%酵母汁1ml，2mg/ml L- trp 2.5ml（50ug/ml）。 4.GMⅡ溶液：1×最低盐溶液97.5ml，50%葡萄糖1ml，5%水解酪蛋白0.08ml，10%酵母汁0.04ml，0.5M MgCl2 0.5ml(2.5mM)，0.1M CaCl2 0.5ml(0.5mM)，2mg/ml L- trp 0.5ml（5ug/ml）。 |
2楼2010-01-08 17:39:56
gxsulong
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zhuifeng7000
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一、取对数末期的菌作为制备感受态细胞 二、转化方法：于第一天上午取一满环枯草芽孢杆菌甘油菌划LB平板，37℃培养箱培养12h。挑单菌落至3ml LB培养基中，37℃， 250 rmin培养过夜。第二天上午取160 μl培养液转接至8 ml SPI培养基中，37℃，250 rmin培养至对数生长末期 (约4~5 h)，取0.2 ml培养液至2 ml SPII培养基中，37℃，100 rmin培养90 min ，加入20ul 10mmolL EGTA，再于37℃，100 rmin培养10分钟。分装成0.5 ml每管，各加入5ul DNA，再于37℃，250rmin培养90分钟，取菌液涂布筛选平板。 试剂： SP盐：0.2%（NH4）2SO4, 1.4%K2HPO4, 0.6%KH2PO4, 0.02%MgSO4•7H2O, 0.1%柠檬酸钠； SPⅠ培养基：SP盐溶液加入1%体积浓度为50%葡萄糖溶液，1%体积100×CAYE溶液； SPⅡ培养基：SPⅠ培养基加入1%体积50mmol/LCaCl2溶液，1%体积250mmol/L MgCl2溶液。 SP－A Salts Solution：（500 ml Solution） 0.4％ (NH4)2SO4 2g 2.8% K2HPO4•3H2O 14g 1.2% KH2PO4 6g 0.2% Trisodium Citrate Dihydrate 1g 121℃灭菌20min SP－B Salts Solution：（500 ml Solution） 0.04% MgSO4•7H2O 0.2g 121℃灭菌20min 100× CAYE Solution：（100 ml Solution） 2％ Casamino acid 2g 10％ Yeast Extract 10g 121℃灭菌20min SPI Medium：（20 mL） 9.8mL SP－A Salts Solution 9.8mL SP－B Salts Solution 200µL （1％V）Glucose（50％w/v，115℃灭菌20min） 200µL （1％V）100× CAYE SPII Medium：（6 mL） 5.88mL SPI Medium 60µL （1％V）50mM CaCl2 60µL （1％V）250mM MgCl2 100×EGTA Solution： 10mmol／L EGTA 溶液，溶解时需加少量NaOH至pH8.0 |
6楼2010-01-20 15:37:42
7楼2010-01-20 15:58:09
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