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lzhwin木虫 (正式写手)
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[交流]
【求助/交流】大家交流一下拟南芥原生质体瞬时表达系统
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拟南芥瞬时表达系统由哈佛大学的Jen Sheen教授建立（07年 nature protocol）Arabidopsis mesophyll protoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis，在蛋白定位、启动子研究以及蛋白蛋白相互作用方面都是很有效的研究工具，最大的优点就是快，因为材料仅仅是14-28天的拟南芥植株，不需要复杂的转基因及筛选。此系统缺点也有很多，主要有两方面：一方面因为植物细胞壁被酶解掉了，因此不适合研究外膜蛋白更没法研究细胞壁；另一方面，原生质体本身存活时间一般不超过72小时，不能连续培养，因此不能用于进行长期观察，当然也不能用来研究与细胞周期有关的问题。 原生质体系统快速的基础是建立在高转化率的基础上的在sheen的文章里，原生质体的转化率达到近90%，但是就我的了解周围的同学没有人能够达到这么高的效率。一般都在10%左右，好一点能接近50%。本人更是很悲剧的发现自己的原生质体转化率为0%。所以想借此讨论一下大家是如何做这个系统的。为了提高转化率对文章上的方法做了哪些改动？ PS:大家尽量说一次自己跟文章上不同的地方，包括各种小的细节。 我先提几个地方： 1、大家都是用FLUKA的PEG4000吗？除此之外其它试剂是用国产分析纯还是进口试剂？ 2、提原生质体时是直接放入酶解液还是经过一步甘露醇？是像文章里一样切成细条还是乱刀切碎？酶解多久？是否用摇床？是否抽真空？ 3、大家一般提100000个原生质体细胞需要多少酶液？ 4、普通质粒小提试剂盒是不可能达到文章上说的1微克每微升的浓度的。大家怎么解决？是用氯化铯纯化还是别的方法？ 5、转化的时候用多少浓度的PEG4000转化多久？ 6、大家一般用什么载体构建瞬时表达载体？puc19 pbluescript or others？ 7、大家的转化体系一般是什么样子的？多少微升多少浓度的细胞加多少质粒？ 8、转化完成之后孵育细胞大家怎么做？用WI 还是W5? 是否光照？直接室温孵育还是恒温孵育？ 9、大家用的W5溶液是否含有葡萄糖？ |
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