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陈思容

铜虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】PCR非特异性扩增,望高手指教

最近一直在做PCR,体系和反应条件换了几次,还是没有出现目的条带,望高手指点迷津!
    我的PCR反应体系:
   10Xbuffer                          2.5ul
   MgCl2(25mmol/L  )        2.0ul
   dNTP(2.5mmol/L  )           1.0ul
   上下游引物(10mmol/L  )各   0.5ul
   Taq酶(5U/ul)              0.5ul
   模板 (真菌基因组DNA)               2.0ul
    加双蒸水至    25ul
PCR反应条件
   94°,10min
   
   94°,1min
   68°,1min
   35cycle

   72°,10min

引物

primer(Oligo6.2):

上游:5' ATGTCCGAGCGACCCTCCGATCTTGTAGTC  3'(30bp)

下游:5' TCACGCCTCTAACATGCCATACTCTTTCTC  3'(30bp)
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陈思容

铜虫 (正式写手)

忘了说了,目的条带830bp,非特异性扩增条带在100-250bp之间,用的是D2000的marker
2楼2010-01-05 17:20:30
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jasco

木虫 (正式写手)

★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
1949stone(金币+2,VIP+0):降五度 可以做个梯度 1-5 17:45
先将退火温度降低5度试试看
3楼2010-01-05 17:27:00
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jasco

木虫 (正式写手)

★ ★ ★
1949stone(金币+3,VIP+0):谢谢交流 1-5 17:45
94°,3min
   
   94°,30sec
   60°,30sec
   72°,1min

   35cycle

   72°,10min
4楼2010-01-05 17:28:43
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陈思容

铜虫 (正式写手)

引用回帖:
Originally posted by jasco at 2010-1-5 17:28:
94°,3min
   
   94°,30sec
   60°,30sec
   72°,1min

   35cycle

   72°,10min

请问为什么会出现非特异性扩增,我前天做了TD-PCR,温度范围从65-50,20个cycle,每个循环降0.5°!
5楼2010-01-05 19:33:54
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1514132

至尊木虫 (著名写手)

上下游引物太少了,可以加到1ul
6楼2010-01-05 20:33:49
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1514132

至尊木虫 (著名写手)

★ ★
司马诸葛(金币+2,VIP+0): 1-5 21:38
妮娜不是非特异条带,看着像是引物二聚体。
7楼2010-01-05 20:35:04
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vivianq

★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
司马诸葛(金币+2,VIP+0): 1-5 21:38
你扩增出来的是引物二聚体.
降低退火温度, 或者重新设计引物.
而且800左右的片段,变性,退火和延伸的时间各45s就够了.
8楼2010-01-05 20:52:06
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陈思容

铜虫 (正式写手)

引用回帖:
Originally posted by 1514132 at 2010-1-5 20:33:
上下游引物太少了,可以加到1ul

1ul的之前做过,有很明显的引物二聚体,我非常确定那个条带不是引物二聚体,我最小的marker是200bp
9楼2010-01-05 21:22:43
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陈思容

铜虫 (正式写手)

引用回帖:
Originally posted by 1514132 at 2010-1-5 20:35:
妮娜不是非特异条带,看着像是引物二聚体。

我确定不是引物二聚体,我最小的marker 是200bp,之前加1ul时候跑出来的引物二聚体是比较窄很整齐的条带
10楼2010-01-05 21:27:22
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