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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】PCR非特异性扩增，望高手指教
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陈思容

铜虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】PCR非特异性扩增，望高手指教

最近一直在做PCR,体系和反应条件换了几次，还是没有出现目的条带，望高手指点迷津！
    我的PCR反应体系：
   10Xbuffer                          2.5ul
   MgCl2（25mmol/L  ）        2.0ul
   dNTP（2.5mmol/L  ）           1.0ul
   上下游引物（10mmol/L  ）各   0.5ul
   Taq酶(5U/ul)              0.5ul
   模板 (真菌基因组DNA)               2.0ul
    加双蒸水至    25ul
PCR反应条件
   94°，10min
   
   94°，1min
   68°，1min
   35cycle

   72°，10min

引物

primer(Oligo6.2):

上游：5' ATGTCCGAGCGACCCTCCGATCTTGTAGTC  3'(30bp)

下游：5' TCACGCCTCTAACATGCCATACTCTTTCTC  3'(30bp)
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1楼 2010-01-05 17:18:02
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陈思容

铜虫 (正式写手)
忘了说了，目的条带830bp,非特异性扩增条带在100-250bp之间，用的是D2000的marker
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2楼2010-01-05 17:20:30
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jasco

木虫 (正式写手)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
1949stone(金币+2,VIP+0):降五度 可以做个梯度 1-5 17:45
先将退火温度降低5度试试看
赞一下(11人) 回复此楼
3楼2010-01-05 17:27:00
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jasco

木虫 (正式写手)
★ ★ ★
1949stone(金币+3,VIP+0):谢谢交流 1-5 17:45
94°，3min
   
   94°，30sec
   60°，30sec
   72°，1min

   35cycle

   72°，10min
赞一下(10人) 回复此楼
4楼2010-01-05 17:28:43
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陈思容

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by jasco at 2010-1-5 17:28:
94°，3min
   
   94°，30sec
   60°，30sec
   72°，1min

   35cycle

   72°，10min

请问为什么会出现非特异性扩增，我前天做了TD-PCR,温度范围从65-50，20个cycle,每个循环降0.5°！
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5楼2010-01-05 19:33:54
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1514132

至尊木虫 (著名写手)
上下游引物太少了，可以加到1ul
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6楼2010-01-05 20:33:49
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1514132

至尊木虫 (著名写手)
★ ★
司马诸葛(金币+2,VIP+0): 1-5 21:38
妮娜不是非特异条带，看着像是引物二聚体。
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7楼2010-01-05 20:35:04
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vivianq

★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
司马诸葛(金币+2,VIP+0): 1-5 21:38
你扩增出来的是引物二聚体.
降低退火温度, 或者重新设计引物.
而且800左右的片段,变性,退火和延伸的时间各45s就够了.
赞一下(11人) 回复此楼
8楼2010-01-05 20:52:06
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陈思容

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by 1514132 at 2010-1-5 20:33:
上下游引物太少了，可以加到1ul

1ul的之前做过，有很明显的引物二聚体，我非常确定那个条带不是引物二聚体，我最小的marker是200bp
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9楼2010-01-05 21:22:43
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陈思容

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by 1514132 at 2010-1-5 20:35:
妮娜不是非特异条带，看着像是引物二聚体。

我确定不是引物二聚体，我最小的marker 是200bp,之前加1ul时候跑出来的引物二聚体是比较窄很整齐的条带
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10楼2010-01-05 21:27:22
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