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sdspring

金虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】PCR扩增求救

需用Pfu酶从基因组扩增2kb,

反应体系:

Template <0.5μg,
Primer1(10μM) 0.5μl
Primer2(10μM) 0.5μl
Buffer 2.5μl
dNTP 2μl
酶 0.3μl
ddH2O 补至25μl


扩增条件:

95℃ 3min

95℃ 30sec
60-64℃ 30sec
72℃ 2min-4min
30个循环

72℃ 10min


产物中有一串连续的10个g


一直扩不出来,请高手赐教!
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ln0401

新虫 (初入文坛)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
1.buffer是否与pfu酶配套
2.建议用保真性好的taq或是taq与pfu混合使用
2楼2010-01-05 10:03:21
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小小豆豆

金虫 (小有名气)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
dntp的浓度是多少,一般用混合dntp时,加的量都较少,2微升太多了吧
3楼2010-01-05 10:28:40
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tianpingpe

新虫 (小有名气)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
1.检查你的模板有问题没有
2,引物设计是否合理
3.有没有阴性对照,如果有阳性对照更好,保证你的扩增体系没有问题
4楼2010-01-05 10:30:17
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jasco

木虫 (正式写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
1.一连串10个G不会影响的,除非整个基因序列GC含量高(加GCbuffer)
2.退火温度是这么高么,根据引物设置,或者touchdown
3.延伸温度,很多pfu最佳延伸温度为68度,
4.延伸效率,一般酶都能做到1kb/min,所以2min足矣
5楼2010-01-05 10:35:30
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wangtengxu

木虫 (正式写手)

1.上图看看
2.一定要做阳性阴性对照(图)
想和有趣的人一起做有趣的事。
6楼2010-01-05 11:47:04
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fungixx

至尊木虫 (文坛精英)

优秀版主优秀版主优秀版主


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
pfu扩增效率是有点低,也建议用taq plus,保真性挺好的扩增效率也挺高。不知道你的引物序列,很可能是退火温度不合适-----
几年前踏上火车那一刻都还没有意识到,从此故乡只有冬夏,再无春秋
7楼2010-01-05 11:51:04
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j2

木虫 (正式写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
同感,退火温度有点高~~~~
修炼ing,当虫仙……
8楼2010-01-05 13:46:51
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runxiaoli

木虫 (正式写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
你设计引物的Tm值是多少,设计的退火温度一般比它低5-10度。做不出来原因可能:模板不合适,或者引物不合适,建议一开始94度,5分钟,94度,45秒,60-64度,50秒。。。试试。希望楼主早日做出想要的结果,加油啦!
9楼2010-01-05 15:12:05
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sdspring

金虫 (初入文坛)

引用回帖:
Originally posted by ln0401 at 2010-1-5 10:03:
1.buffer是否与pfu酶配套
2.建议用保真性好的taq或是taq与pfu混合使用

谢谢!

buffer是pfu酶专用的,应该没问题。
10楼2010-01-06 10:57:52
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