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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】PCR扩增求救
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sdspring

金虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】PCR扩增求救

需用Pfu酶从基因组扩增2kb，

反应体系：

Template <0.5μg，
Primer1(10μM) 0.5μl
Primer2(10μM) 0.5μl
Buffer 2.5μl
dNTP 2μl
酶 0.3μl
ddH2O 补至25μl


扩增条件：

95℃ 3min

95℃ 30sec
60-64℃ 30sec
72℃ 2min-4min
30个循环

72℃ 10min


产物中有一串连续的10个g


一直扩不出来，请高手赐教！
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1楼 2010-01-05 09:43:49
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ln0401

新虫 (初入文坛)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
1.buffer是否与pfu酶配套
2.建议用保真性好的taq或是taq与pfu混合使用
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2楼2010-01-05 10:03:21
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小小豆豆

金虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
dntp的浓度是多少，一般用混合dntp时，加的量都较少，2微升太多了吧
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3楼2010-01-05 10:28:40
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tianpingpe

新虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
1.检查你的模板有问题没有
2，引物设计是否合理
3.有没有阴性对照，如果有阳性对照更好，保证你的扩增体系没有问题
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4楼2010-01-05 10:30:17
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jasco

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
1.一连串10个G不会影响的，除非整个基因序列GC含量高（加GCbuffer）
2.退火温度是这么高么，根据引物设置，或者touchdown
3.延伸温度，很多pfu最佳延伸温度为68度，
4.延伸效率，一般酶都能做到1kb/min，所以2min足矣
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5楼2010-01-05 10:35:30
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wangtengxu

木虫 (正式写手)
1.上图看看
2.一定要做阳性阴性对照（图）
赞一下 回复此楼
想和有趣的人一起做有趣的事。
6楼2010-01-05 11:47:04
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fungixx

至尊木虫 (文坛精英)

优秀版主优秀版主优秀版主
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
pfu扩增效率是有点低，也建议用taq plus,保真性挺好的扩增效率也挺高。不知道你的引物序列，很可能是退火温度不合适-----
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几年前踏上火车那一刻都还没有意识到,从此故乡只有冬夏,再无春秋
7楼2010-01-05 11:51:04
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j2

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
同感，退火温度有点高~~~~
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修炼ｉｎｇ，当虫仙……
8楼2010-01-05 13:46:51
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runxiaoli

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
你设计引物的Tm值是多少，设计的退火温度一般比它低5-10度。做不出来原因可能：模板不合适，或者引物不合适，建议一开始94度，5分钟，94度，45秒，60-64度，50秒。。。试试。希望楼主早日做出想要的结果，加油啦！
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9楼2010-01-05 15:12:05
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sdspring

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by ln0401 at 2010-1-5 10:03:
1.buffer是否与pfu酶配套
2.建议用保真性好的taq或是taq与pfu混合使用

谢谢！

buffer是pfu酶专用的，应该没问题。
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10楼2010-01-06 10:57:52
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